免疫学技术概论

关于免疫学技术概论[目的与要求]1、了解最新的免疫学诊断技术以及细胞免疫技术的种类与用途；

2、掌握常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因素；

3、掌握生物技术公司常用的免疫制备技术；

4、了解免疫学技术的应用及其发展趋向。[难点与重点]

重点：常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因素；生物技术公司常用的免疫制备技术。难点：常用的免疫血清学技术及其实验原理、影响因素。第2页,共50页，2024年2月25日，星期天

免疫学技术是指利用免疫反应的特异性原理，建立各种检测与分析技术以及建立这些技术的各种制备方法，包括：①用于抗原或抗体检测的体外免疫反应技术，或称免疫检测技术，这类技术一般都需要血清进行试验，故又称为免疫血清学反应或免疫血清学技术；②用于研究机体细胞免疫功能与状态的细胞免疫技术；③用于建立免疫检测方法的免疫制备技术，如抗体或抗原的纯化技术、抗体的标记技术。第3页,共50页，2024年2月25日，星期天E-玫瑰花环实验正常人外周血中T细胞在体外能直接和绵羊红细胞(SRBC)结合形成玫瑰花样细胞团。这是因为人的T细胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相结合的受体，称为E受体。已证实E受体是人T细胞所特有的表面标志，因此本试验可作为人外周血T细胞的鉴定和计数，同时作为人细胞免疫功能状态的一个检测指标，也是分离T细胞的常用方法之一。免疫标记技术第4页,共50页，2024年2月25日，星期天第1节免疫血清学技术概述

抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合反应，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术，是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术。免疫血清学技术自19世纪建立了最早和最简单的凝集试验开始，不断发展，尤其是近20余年来，各种新方法、新技术层出不穷，应用面也日益扩大，已深入到生物学科的各个研究领域。第5页,共50页，2024年2月25日，星期天

免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为凝聚性反应(包括凝集试验和沉淀试验)、标记抗体技术(包括荧光抗体、酶标抗体、放射性同位素标记抗体、化学发光标记抗体技术等)、有补体参与的反应(补体结合试验、免疫黏附血凝试验等)、中和反应(病毒中和试验等)等已普遍应用的技术，以及免疫复合物散射反应(激光散射免疫测定)、电免疫反应(免疫传感器技术)、免疫转印(westernb1otting)以及建立在抗原抗体反应基础上的免疫蛋白芯片技术等新技术。一、免疫血清学技术的类型第6页,共50页，2024年2月25日，星期天凝集试验（血球凝集）凝集试验（细菌凝集）补体结合试验抗原-抗体反应模式图第7页,共50页，2024年2月25日，星期天凝集反应沉淀反应对流免疫电泳火箭免疫电泳第8页,共50页，2024年2月25日，星期天二、免疫血清学反应的一般特点(一)特异性与交叉性血清学反应具有高度特异性。这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。一般血缘越近，交叉反应的程度也越高。除相互交叉反应外，也有表现为单向交叉的，单向交叉在选择疫苗用菌(毒)株时有重要意义。天花牛痘第9页,共50页，2024年2月25日，星期天(二)抗原与抗体结合机理

抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结合，其结合力决定于抗体的抗原结合位点与抗原表位之间形成的非共价键的数量、性质和距离，由此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。

第10页,共50页，2024年2月25日，星期天(二)抗原与抗体结合机理

抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这一过程受物理、化学、热力学的法则所制约，结合的温度应在0～40℃，pH在4～9。如温度超过60℃或pH降到3以下时，则抗原抗体复合物又可重新解离。利用抗原抗体既能特异性地结合，又能在一定条件下重新分离这一特性，可进行免疫亲和层析，以制备免疫纯的抗原或抗体。第11页,共50页，2024年2月25日，星期天

抗原与抗体在适宜的条件下就能发生结合反应。但对于常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集、沉淀等可见反应结果，在最适比例时，反应最明显。这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应的现象，称为带(zone)现象。

(二)抗原与抗体结合机理

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为了克服带现象，在进行血清学反应时，需将抗原和抗体作适当稀释，通常是固定一种成分而稀释另一种成分。为了选择抗原和抗体的最适用量，也可同时递进稀释抗原和抗体，用综合变量法进行方阵测定。(二)抗原与抗体结合机理

第13页,共50页，2024年2月25日，星期天第14页,共50页，2024年2月25日，星期天(三)免疫血清学反应的影响因素影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH值等。1、电解质特异性的抗原和抗体具有对应的极性基(羧基、氨基等)，它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。此时易受电解质的作用失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。因此，需在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。故血清学反应一般用生理盐水作稀释液，标记抗体技术中，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)作稀释液。第15页,共50页，2024年2月25日，星期天2、温度在一定温度下，将抗原抗体保温一定时间，可促使两个阶段的反应。较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。将抗原、抗体反应通常在37℃(培养箱或水浴)，也可在室温下进行；亦可用56℃水浴反应更快。有的抗原或抗体系统在低温长时间结合反应更充分，如有的补体结合反应在冰箱低温结合效果更好。(三)免疫血清学反应的影响因素影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH值等。第16页,共50页，2024年2月25日，星期天3、酸碱度血清学反应常用pH为6～8，过高或过低的pH值可使抗原抗体复合物重新离解。如pH值降至抗原或抗体的等电点时，可引起非特异性的酸凝集，造成假象，出现假阳性。(三)免疫血清学反应的影响因素影响免疫血清学反应的因素主要有电解质、温度、pH值等。第17页,共50页，2024年2月25日，星期天第2节细胞免疫技术的种类与用途细胞免疫技术是指与细胞免疫有关的各种检测技术，包括对其免疫细胞、细胞因子的检测及功能分析。由于人们越来越认识到细胞免疫在肿瘤、胞内菌感染、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近几年来细胞免疫技术在医学和兽医学研究与临床中应用越来越广。

第18页,共50页，2024年2月25日，星期天第19页,共50页，2024年2月25日，星期天第2节细胞免疫技术的种类与用途

根据被检测的物质性质不同，可将细胞免疫技术分为淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能测定技术和细胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验等4大类。CIK是(cytokineinducedkiller)的缩写，最初是指在正常人体外周血中只占1～5%的cd3+cd56+的T淋巴细胞｡目前国内外制备的用于过继免疫治疗的cik细胞，实际上是体外扩增出的以cd3+cd56+､cd3+cd8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞因子如IL-2､IFN-γ及某些单克隆抗体(anti-cd3mcab)的刺激下，由从外周血､骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性｡第20页,共50页，2024年2月25日，星期天第2节细胞免疫技术的种类与用途

根据被检测的物质性质不同，可将细胞免疫技术分为淋巴细胞计数及分类技术、淋巴细胞功能测定技术和细胞因子检测技术以及体内细胞免疫试验等4大类。生物治疗技术是一种“自身免疫细胞疗法”，它用“人体自身的免疫细胞杀死自己体内的肿瘤细胞”的原理来治疗肿瘤，是最具优势、最有前景的肿瘤治疗技术之一。通过提取患者自身外周血中的单个核细胞，在GMP超洁净实验室中进行诱导，激活和数量扩增成树突状细胞（DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），然后再回输给病人。这两种细胞对肿瘤细胞有特异性识别作用，能够广泛识别各种肿瘤细胞。当DC与CIK细胞联合作用将残留恶性肿瘤细胞完全杀灭或降低并稳定在一定水平时，即可达到肿瘤的临床治疗或控制肿瘤的复发和转移。第21页,共50页，2024年2月25日，星期天

该技术有效修复、增强了人体的免疫系统，减少了肿瘤细胞转移的几率，无痛苦，无副作用，对于手术结束后或放疗缓解期患者尤为适合。对于部分乙肝患者也可采用该方法治疗

生物免疫治疗大致分为五个主要步骤，首先是前期检查，第二是采集外周血中的单个核细胞，第三步就是细胞在实验室的激活、诱导与质控，第四步是回输第22页,共50页，2024年2月25日，星期天CIK细胞的特点1、增殖能力强，主要效用细胞CD3+CD56+可增殖1000倍；2、杀伤活力强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子γ干扰素、白细胞介素2等；3、杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用，对多重耐药肿瘤细胞仍敏感，杀瘤活性不受环孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，无严重不良反应。不过长度超过30bp的dsRNA会由于干扰素α应答引发非特异性基因抑制。第23页,共50页，2024年2月25日，星期天CIK细胞治疗技术的优势1、可有清除手术、放化疗后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移；2、可与放、化疗联合使用，能降低放化疗的毒副作用的感染率，提高放化疗的疗效；3、可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗；第24页,共50页，2024年2月25日，星期天CIK细胞治疗技术的优势4、对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者，能迅速缓解其临床症状，延长生存期；大部分患者出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤生存的治疗效果；5、由于CIK细胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在治疗肿瘤的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，脱发停止甚至头发生长或白发变黑等“年轻化”表现，及精神状态或体力明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量，延长生存期。第25页,共50页，2024年2月25日，星期天第26页,共50页，2024年2月25日，星期天第27页,共50页，2024年2月25日，星期天第28页,共50页，2024年2月25日，星期天第29页,共50页，2024年2月25日，星期天第30页,共50页，2024年2月25日，星期天第31页,共50页，2024年2月25日，星期天激光共聚焦显微镜第32页,共50页，2024年2月25日，星期天第33页,共50页，2024年2月25日，星期天第34页,共50页，2024年2月25日，星期天第35页,共50页，2024年2月25日，星期天

细胞免疫技术的特点：（1）方法复杂，根据不同检测对象需采用不同的方法，这也是细胞免疫技术发展不快的原因；（2）目前逐渐发展用血清学方法检测细胞免疫，如用单克隆抗体检测CD抗原进行T细胞亚群分析，血清学反应测定白细胞介素和干扰素等，即细胞免疫技术与血清学技术融为一体。

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细胞免疫技术的特点：此外，近年来各种先进的检测仪器应用于细胞免疫技术，如流式细胞仪(flowcytometer)、激光共聚焦显微镜等，使免疫细胞表面分子的检测、定位及其功能的研究有了较大的发展。第37页,共50页，2024年2月25日，星期天第3节免疫制备技术的种类

免疫制备技术是指制备与免疫检测有关制剂的各种技术，包括抗原制备、抗体制备、抗体纯化及抗体标记等技术。第38页,共50页，2024年2月25日，星期天第4节免疫学技术的应用一、动物疫病诊断用免疫血清学方法对动物传染病、寄生虫病等进行诊断，是免疫学技术最突出的应用。应用免疫血清学技术可以检测病原微生物抗原或抗体，其中酶标抗体技术，已成为动物多种传染病的常规诊断方法，其简便、快速，又具有高度的敏感性、特异性和可重复性，已有许多商品化的酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断试剂盒。第39页,共50页，2024年2月25日，星期天二、动植物生理活动研究动物、植物体中存在一些活性物质，如激素、维生素等，它们在体内含量极微少，但在调节机体的生理活动中起重要作用，因此可通过分析测定这些生物活性物质的含量及变化来研究机体的各种生理功能(如生长、生殖等)。由于这些物质含量极低，用常规检测方法不能准确测出。第40页,共50页，2024年2月25日，星期天二、动植物生理活动研究目前放射免疫测定和酶免疫技术已能精确测出ng(10-9g)及pg(10-12g)级水平的物质，它们已成为测定动物、植物、以及昆虫体内微量激素及其他活性物质、植物生理和生物防治的重要技术手段。第41页,共50页，2024年2月25日，星期天三、物种及微生物鉴定各种生物之间的差异都可表现在抗原性的不同，物种种源越远，抗原性差异越大，因此可用区分抗原性的血清学反应进行物种鉴定与物种的分类等工作。血清学反应在细菌、病毒等微生物鉴定和血清型及亚型的分析方面已得到广泛应用。但在动物种源、植物和昆虫分类方面还是一个新领域。第42页,共50页，2024年2月25日，星期天四、动植物性状的免疫标记通过分析动物、植物一些优良性状(如高产、优质、抗逆性等)的特异性抗原，然后用血清学方法进行标记选择育种，是一个很有前途的方向，它比分子遗传标记选择育种简便。第43页,共50页，2024年2月25日，星期天五、生物制品研究生物制品(如疫苗、诊断制品、免疫增强剂等)的研究与开发，免疫学技术是必不可少的支撑技术。疫苗研究中需用血清学技术和细胞免疫技术作为免疫效力的评价手段。在研究一些免疫增强药物，尤其研究抗肿瘤药物时，需用细胞免疫技术分析测定它们对机体细胞免疫功能的增强作用。第44页,共50页，2024年2月25日，星期天六、动物疫病致病机理研究动物传染病的病原从机体特定部位感染，并在特定组织细胞内增殖，引起致病。采用免疫荧光抗体染色或免疫酶组化染色技术，可在细胞水平上确定病毒等病原微生物的感染细胞，还可用免疫电镜技术等，在亚细胞水平上进行抗原的定位。免疫学技术还可用于研究自身免疫病和变态反应性疾病的发病机理。第45页,共50页，2024年2月25日，星期天七、分子生物学研究在基因工程研究中，目的基因的分离