基因工程生化产品制备原理及方法

关于基因工程生化产品制备原理及方法§10.1概述生物技术最为活跃的研究领域为医学领域→集中于开展活性蛋白和多肽类药物及单克隆抗体的研究人类基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究的进展，转基因动物与植物、蛋白质工程、抗体工程、基因治疗和生物芯片等新技术的建立且取得重大突破与发展→新型生物技术产业第一个生物技术药物：人胰岛素，1982年第2页,共51页，2024年2月25日，星期天生物技术医药产业1993年生物技术医药产品销售达77亿美元，2000年已超过200亿美元已得到临床应用的基因工程药物有：人胰岛素、人生长激素、干扰素、乙肝疫苗、人促红细胞生成素（EPO）、GM－集落刺激因子（GM－CSF）、组织溶纤酶原激活素、白细胞介素－2及白介素－11等。正在研究的有降钙素因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等140多种。随着生物技术药物的发展，多肽与蛋白质类药物的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给生物制剂带来了新的挑战。第3页,共51页，2024年2月25日，星期天蛋白质药物的应用限制实际应用中，蛋白质类药物受到一定限制，大多数只能注射给药或局部用药。Why？为克服这些缺陷→合成这些天然蛋白质的较小活性片段，即“多肽模拟”或“多肽结构域”，又叫“小分子结构药物设计”。可口服，有利于由皮肤、粘膜给药，用于治疗免疫缺陷症、HIV感染、风湿性关节炎等，其制造成本也更低。该设计思想也已应用于多糖类药物、核酸类药物和模拟酶的有关研究。小分子药物设计属于第二代结构相关性药物设计，能替代原先天然活性蛋白与特异靶相互作用口服应用时生物利用度低，会受到消化酶的破坏，在胃酸作用下不稳定，在体内半衰期较短第4页,共51页，2024年2月25日，星期天在给药方式的研究方面，对注射用溶液和注射用无菌粉末（目前上市的多肽蛋白质类药物多为此种剂型），除了继续改进其稳定性外，还通过一些其他技术手段，研制出了化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。如PEG修饰能有效地改善多肽蛋白质类药物的免疫原性，增加稳定性，延长体内半衰期，减少毒副作用等。PEG-腺苷脱胺酶已投放市场，PEG-天冬酰胺酶，PEG-IL-2，PEG-SOD，均已进入临床。非注射途径的给药如鼻腔、直肠、肺部给药方面也取得重大进展。第5页,共51页，2024年2月25日，星期天基因工程药物的研究进展第一代基因工程药物是针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病。应用基因工程技术去扩大这类多肽蛋白质的产量以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的需要，主要是以蛋白质激素类为代表的，如人胰岛素、胰高血糖素、人生长激素、降钙素、生长激素及α-EPO等。第二代基因工程药物是根据内源性多肽蛋白的生理活性，应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质，以超正常浓度剂量供给人体，以激发它们的天然活性作为其治疗疾病的药理基础，主要是以细胞生长调节因子为代表的，如G-CSF，GM-CSF，α-IFN，γ-IFN和tPA等。第6页,共51页，2024年2月25日，星期天基因工程药物的研究进展应用重组DNA技术表达人源性抗体或将抗体小型化(如Fab抗体，单链抗体、单域抗体，分子识别抗体等)，与非人源化抗体和完整抗体相比，其免疫原性弱，穿透力强，表达效率高。人源化抗体药物和小型化抗体靶向药物正成为肿瘤治疗，自身免疫性疾病，器官移植排斥和艾滋病防治药物的又一研究热点。

第7页,共51页，2024年2月25日，星期天利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。从1982年重组胰岛素批准上市以来，现已有近40种基因工程蛋白质药物投放市场，主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病等疑难病。近年来，利用转基因植物生产基因工程疫苗和利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物的研究也取得重大进展。第8页,共51页，2024年2月25日，星期天1、转基因植物基因工程疫苗1990年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅速的发展。将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马铃薯、蕃茄、香蕉等植物。

第9页,共51页，2024年2月25日，星期天2、转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物，其成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低→近年不少研究者从事转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究。基本方法：将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游，然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞，当转基因胚胎长成个体后，在泌乳期药用蛋白质基因表达，从动物乳汁可获得基因工程药物。第10页,共51页，2024年2月25日，星期天2、转基因动物乳腺生物反应器1988年开始在大哺乳动物乳腺生物反应器中表达基因工程药物以来，在动物的奶汁中生产出的人类蛋白质药物：牛奶：抗凝血酶、纤维蛋白原、人白血清蛋白、胶原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基转移酶、蛋白C等；山羊奶：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、组织型溶纤维原激活因子、单克隆抗体；绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纤维蛋白原、蛋白质C，猪奶中亦有蛋白质C、凝血因子IX、纤维蛋白原、血红蛋白。乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究已取得了一些成功经验，但离商业化生产还有距离。

第11页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.2基因工程生化产品的制备程序现代生物技术生化产品：将生物体内生物活性物质的基因分离出来，然后用重组DNA技术加以改造，使其在细菌、酵母、动物细胞或转基因动物中大量表达，通过这种方式生产的新型生化产品基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌或细胞，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术→使得很多从自然界很难或不能获得的蛋白质得以大规模合成第12页,共51页，2024年2月25日，星期天一、基因工程研发的程序1）制备基因工程菌株（或细胞）及实验室小试阶段→主要涉及到DNA重组技术（基因工程上游技术）2）中试与质量检定阶段→主要涉及基因工程产物的分离、纯化（基因工程下游技术）3）临床前研究阶段4）临床试验阶段5）试生产阶段第13页,共51页，2024年2月25日，星期天二、基因工程的基本过程通过对核酸分子的剪接、重组和插入而实现遗传物质重新组合，再借助质粒、病毒、细菌或其它载体，将重组基因转移到新宿主细胞，使其在新宿主细胞系统内复制和表达1）目的基因的制备2）载体的制备3）目的基因与载体的连接4）将含目的基因的表达载体引入受体细胞并在其中复制表达5）筛选带有重组目的基因的转化子6）鉴定目的基因的表达产物第14页,共51页，2024年2月25日，星期天基因工程生化药物的生产上游阶段：分离目的基因、构建工程菌（细胞）；主要在实验室完成；目的基因获取后，要选择适当的表达系统→原核系统和真核系统。主要考虑的是要保证蛋白质的功能，其次考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易下游阶段：从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。包括:工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器的设计和制造。与传统发酵不同，需对影响目的基因表达的因素进行分析第15页,共51页，2024年2月25日，星期天三、获得目的基因合成一段与目的DNA双链的两个3‘末端部分序列互补的、20余个碱基的寡核苷酸作为引物（primer）目的DNA变性后（单链模板），加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热聚合酶。T↓，引物将与待扩增的DNA链复性结合，在聚合酶的作用下，不断延伸合成新互补链（1条DNA双链→两条）。变性（90-95℃）→复性（50-55℃）→引物延伸（60-72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段（可使DNA扩增100余万倍）。PCR反应特异性强，灵敏度高，极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。1、利用聚合酶链式反应获得基因第16页,共51页，2024年2月25日，星期天来源于真核细胞的产生基因工程生化产品的目的基因，不能直接分离、克隆，Why？PCR反应设计引物时，可根据需要，在5‘延伸，添加限制酶识别序列及转录和翻译调控序列，或者利用碱基错配，对5’端密码子进行定点诱变，以改造翻译起始区序列，提高基因表达效率第17页,共51页，2024年2月25日，星期天2、从DNA文库筛选基因1）制备基因文库a.基因组文库：由一种生物的基因组得到的DNA片段的集合，其中每个片段都连接到一个克隆载体上，该种生物的全部遗传信息由文库中的全部DNA片段代表。制备或选择克隆载体→限制性酶局部消化基因组DNA→用蔗糖密度梯度离心法除去不适合克隆到选定载体中的片段→将基因组DNA片段和切开的载体DNA混合、连接→用连接物转化细菌细胞（载体为质粒）或体外包装成噬菌体颗粒（载体为噬菌体）→得到含有不同重组DNA分子的基因组文库第18页,共51页，2024年2月25日，星期天b.cDNA文库：只含有在一定生物或一定细胞和组织中表达的基因表达目的基因的细胞中提取总RNA，寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从总RNA中提取mRNA，以mRNA为模板，利用逆转录酶合成互补DNA，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链，将产生的双链cDNA片段插入到适当的载体中克隆RNA转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，cDNA文库适于在原核中表达，但cDNA只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列（需根据表达载体的结构配以相应的调控序列）真核生物基因中通常含有非编码区及内含子，在原核细胞宿主中不能正常表达，基因库中的基因一般不能用于原核表达系统的基因工程第19页,共51页，2024年2月25日，星期天2）DNA文库中筛选目的基因每个基因都有唯一的核苷酸序列，利用与该基因互补的标记DNA片段（探针）检出目的基因探针可用放射性同位素标记，也可用非放射性物质如生物素、地高辛、荧光素等标记作为探针的DNA片段，可为另一物种克隆的同源基因，也可为根据目的基因产物蛋白质的氨基酸序列和遗传密码知识设计合成的寡核苷酸序列第20页,共51页，2024年2月25日，星期天利用标记DNA探针从DNA文库中筛选目的基因的方法：1）硝酸纤维素膜或特制尼龙膜印在含有许多单菌落的琼脂平板上（每个菌落都含有不同的重组DNA），每个菌落都有一些细胞黏在膜上，形成平板影印膜2）碱处理滤膜，变性后DNA仍留在原来菌落的位置3）标记探针加到滤膜上，只与含有互补DNA序列的目的基因退火，使相应菌落所在位置带上标记4）通过放射性自显影显现标记的菌落（目的基因的克隆）许多生长因子的早期基因工程都是利用cDNA基因第21页,共51页，2024年2月25日，星期天3、人工合成基因已知蛋白质的氨基酸序列或其基因的核苷酸序列，可利用DNA合成仪合成编码该蛋白的基因现有DNA合成仪能力限制，先需分段合成目的基因的核苷酸序列，再将这些片段连接成完整基因可根据需要修改密码子：采用宿主细胞偏爱的密码子；在结构基因的适当位置添加转录和翻译调控序列；在目的基因的两侧添加限制酶识别序列，以利于和载体的连接许多细胞生长因子：胰岛素、表皮生长因子、干扰素、EPO等都采用了人工合成基因第22页,共51页，2024年2月25日，星期天4、载体的制备与连接表达载体除了具有一般克隆载体的特性外，还需有强的启动子、增强子、终止子及翻译调控序列如SD序列等表达载体的构建或选择由所用宿主类型和表达战略两因素决定不同的宿主有不同的表达载体；大肠杆菌表达系统可采用直接表达、融合表达和分泌型表达三种不同战略非融合表达载体：pBV220；pET系统；分泌型表达载体等第23页,共51页，2024年2月25日，星期天（共有24种核酸内切限制酶对pBR322DNA分子只具有单一识别位点。其中有9种限制酶其识别位点位于四环素抗性基因区，还有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活→因DNA插入而导致基因失活的现象称为插入失活效应。）具有较小的分子量(4361bp)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号（每个细胞中可累积1000～3000个拷贝）具较高的拷贝数第24页,共51页，2024年2月25日，星期天5、目的基因与载体连接根据目的基因和载体制备过程中产生的末端性质不同，可采用黏性末端连接、平头末端连接和人工接头连接三种不同的连接策略6、转化：细胞在一定生理状态即感受态（competence）时，可摄取外源遗传物质，摄入的遗传物质可独立复制或在体内重组成为宿主细胞染色体的一部分，并带给宿主细胞某些新的遗传形状→不同宿主需用不同的方法处理方法氯化钙转化法原生质体-PEG转化法电穿孔法适用范围E.coli、葡萄球菌、其它G－枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酵母菌微生物、植物细胞、动物细胞DNA连接酶主要来自T4噬菌体和大肠杆菌DNA连接酶T4DNA连接酶催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率高。大肠杆菌DNA连接酶不能催化DNA分子平端连接第25页,共51页，2024年2月25日，星期天EcoRI的识别序列5‘-G_AATTC-3’3’-CTTAA_G-5’SmaI的识别序列5‘-CCC_TTT-3’3’-TTT_CCC-5’EcoRI的同尾酶MunI的识别序列是5'-C_AATTG–3‘3'-GTTAA_C–5'第26页,共51页，2024年2月25日，星期天7、转化子的筛选和鉴定1）抗药性筛选（质粒载体几乎都带有某种抗药性基因作为筛选标记）→问题：只要在抗生素平板上或培养液中生长的菌体一定为含有目的基因的重组菌吗？2）单菌落快速电泳：抗药性转化子单菌落随机挑出→快速提取质粒→电泳检测→电泳结果判断（比载体分子量大or小）？3）限制酶图谱分析（对初步筛选的转化子细胞或质粒DNA进行限制酶切分析)4）Southern印迹杂交或菌落原位杂交：重组质粒抽提→经或不经过酶切，琼脂糖电泳→转纤维素膜，标记mRNA或cDNA为探针，Southern印迹杂交；也可不经电泳，进行菌落原位杂交5）基因及表达产物的鉴定：测定核苷酸序列、通过免疫分析鉴定基因表达产物的存在，直接测定产物的氨基酸序列、功能活性第27页,共51页，2024年2月25日，星期天第28页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3大肠杆菌表达系统的优化大肠杆菌表达系统的特点：不存在信号肽，产品多为胞内产物（提取时需破胞→较多杂质释放出来）分泌能力不足，真核蛋白常形成不溶性包含体→表达产物需经变性和复性不存在翻译后修饰→不能糖基化翻译起始：甲硫氨酸的AUG密码子开始→N端多余Met残基→引起免疫反应易产生难除去的内毒素、蛋白酶破坏等第29页,共51页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌表达系统大肠杆菌产物的形式：胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶表达、细胞周质表达等影响真核基因在E.coli中表达效率的主要因素：启动子强度翻译起始区序列mRNA的二级结构密码子选择、转录终止质粒拷贝数、质粒稳定性和宿主细胞生理学第30页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.1选择和构建强的启动子启动子：与RNApolymerase结合并启动RNA转录的40－50bp的DNA序列原核细胞启动子有-10区和-35区两个保守区域必须选用原核生物的强启动子，且该强启动子必须受到控制或可诱导的（目的？）E.coli常用的强启动子有：Lac、Trp、Tac、λPL和T7启动子第31页,共51页，2024年2月25日，星期天E.coli常用强启动子Lac、LacUV5（突变的Lac启动子）→异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导Trp：色氨酸饥饿或色氨酸的竞争性抑制剂β-吲哚丙烯酸诱导Tac：IPTG诱导λPL：

λ噬菌体cI阻遏物基因的温度敏感型突变基因cIts857调控转录，42oC诱导T7：IPTG诱导第32页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.2优化翻译起始区SD序列或核糖体结合位点rbs：位于其实密码子AUG上游3－11bp，由3－9bp组成，富含A、T核苷酸，若4个A或4个T能产生最高的翻译效率AUG前面的三联体也能影响翻译效率：在β半乳糖苷酶mRNA中，该三联体最好为UAU和CUU，AUG后面的密码子组成也影响翻译效率§10.3.3优化mRNA二级结构mRNA的起始密码子和SD序列不应该形成双链结构→便于接近30S核糖体、mRNA5’末端和SD序列间距离会影响翻译、SD序列和起始密码子之间的距离变化也影响翻译第33页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.4使用宿主偏爱的密码子多数氨基酸有一个以上的密码子大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子（稀有密码子）密码子利用或偏爱对翻译过程的延伸有深刻的影响。例如，如果mRNA有很多成簇的稀有密码子，这可能对核糖体的运动速度造成负面影响，大大减低了蛋白表达水平。密码子最佳化：利用偏爱密码子(preferredcodons)并避免利用率低的或稀有的密码子合成基因。第34页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.5提高质粒拷贝数利用高拷贝质粒克隆目的基因：多数是colEI质粒的衍生物colEI复制受两种负调节因子控制：RNAI（一种180个核苷酸的非翻译RNA）、蛋白质阻遏物RopRop基因缺失（如pAT153质粒）或RNAI突变→均可使质粒拷贝数增加已构建一些质粒，其拷贝数受可调节启动子控制，有两个复制原点：其一在30度有活性，与par基因序列结合后，维持质粒的的拷贝数；另一个复制原点使λPL启动子取代了RNAII基因启动子（cI857菌株中，阻遏物受温度诱导失活时才有功能→维持高拷贝数）第35页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.6利用强转录终止子一些强的启动子可能引起转录通读、使转录超过真核基因终止信号，产生超长转录物副作用：增加细胞能量消耗或使转录物形成非需要的二级结构→降低翻译效率，还可能干扰其它必须基因或调节基因的转录（Rop基因连读）酵母和哺乳动物偏爱的终止密码子分别是UAA和UGA，单子叶植物最常利用UGA，而昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA第36页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.7增强质粒稳定性外源基因的高效表达导致细胞生长速率降低或形态学变化，如成为纤丝状或减少质粒拷贝数质粒不稳定性：若产生丢失质粒或发生结构重排的突变体（不再表达重组基因或减少质粒拷贝数），则可能具有更快的生长速度，并迅速在培养物中占优势原因：分配不稳定性（分配缺陷引起质粒丢失，避免方法：质粒中尽量保留一个负责分配功能的par区/反选择无质粒细胞/消除质粒多聚化）；结构不稳定性（由DNA缺失、插入或重排产生的质粒不稳定性，利用阻遏物控制外源基因的表达）第37页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.3.8宿主细胞生理学营养成分及其提供方式，环境参数如温度、pH和溶解氧等目前，无生长条件对外源蛋白在大肠杆菌中合成的影响相关的系统研究，可供参考资料不多宿主细胞生理学对外源基因表达的重要性：高效表达的外源蛋白在E.coli中往往形成包含体，但降低培养温度或采用降低细胞生长速率地培养基组成和pH均能增加正确折叠的蛋白的含量第38页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.4非大肠杆菌表达系统非大肠杆菌宿主系统：枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞及其幼体、哺乳动物细胞和转基因动物等§10.4.1枯草芽孢杆菌系统（B.subtilis）优点：分泌能力强，表达的蛋白质一般穿过质膜，进入培养基中，不形成包含体→产物后处理简单（成本↓），无致病性，不产生内毒素缺点：不能使蛋白质产物糖基化，有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解第39页,共51页，2024年2月25日，星期天枯草芽孢杆菌系统特点革兰氏阳性专性需氧菌，近30％的基因起始密码子为UGC（Cys）或CUG（Ile）E.coli质粒在B.subtilis中不能有效复制，而B.subtilis本身的天然质粒都为隐蔽型质粒，没有可检测的表型→不能用于基因克隆S.aureus中分离的质粒有些具有抗生素特性，如PC194、pE194、pUB110及pTL27等能转化B.subtilis并在其中正常复制和表达抗生素特性第40页,共51页，2024年2月25日，星期天枯草芽孢杆菌系统特点直接在B.subtilis中克隆由于治理的结构和分配不稳定而遇到困难→构建穿梭载体（在两种生物细胞如E.coli和B.subtilis中保持和复制的质粒载体）常用穿梭载体：pHV系列、pHP系列、pEB10和pLB5等B.subtilis的表达载体中，一些是以E.coli的lac系统、λ噬菌体或B.subtilis

的φ105→温度敏感性阻遏物为基础构建的；有些是以的蔗糖诱导性基因sacB的调节区为基础构建的第41页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.4.2酵母表达系统特点：最简单的真核生物，E.coli的许多遗传操作方法均适用于酵母；安全无毒，易培养，遗传背景清楚，适于大规模生产，能进行翻译后修饰加工如糖基化→一些经过糖基化修饰才有生物活性的蛋白酵母常用载体：酵母附加体质粒YEp、复制型质粒YRP、着丝粒型质粒YCP、整合型质粒YIP、人造酵母染色体YAC等外源基因的拷贝数、启动子、分泌信号、终止序列、宿主菌株等都会影响外源基因的表达第42页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.4.3昆虫细胞及幼体表达系统主要载体为感染昆虫的杆状病毒，有：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）NPV病毒在正常感染期间，产生和包含体为一种多角体蛋白，不是病毒复制所必须，可用外源基因取代多角体蛋白基因。多角体蛋白基因的启动子为极强启动子，在病毒感染细胞后期，多角体蛋白可达细胞总蛋白的50％AcMNPV感染秋黏虫；BmNPV感染家蚕第43页,共51页，2024年2月25日，星期天§10.4.4哺乳动物细胞系统哺乳动物细胞系统优点：表达产物可分泌到培养液中，培养液成分可人为控制，易于分离纯化，产物是糖基化的，具有与自然分子一样的功能缺点：动物细胞生长慢，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度小，且表达所用传代细胞一般认为均是恶性化细胞，致癌？哺乳动物细胞无类似质粒的载体可以利用，外源基因必须整合到宿主细胞染色体中才能在其中复制表达第44页,共51页，2024年2月25日，星期天哺乳动物细胞系统操作方法1、外源基因导入哺乳动物细胞的方法：电穿孔法、病毒载体导入法（SV40、重组痘苗病毒、腺病毒和逆转录病毒）、纤维注射法、脂质体包裹法、磷酸钙-DNA共沉淀法等2、选择性标记基因：单纯疱疹病毒（HSV）腺苷激酶基因（HSV

tk）和二氢叶酸还原酶（DHFR）氡甲蝶呤（DHFRMtx）系统3、外源基因在哺乳动物细胞中的高水平表达p512第45页,共51页，202