分子杂交技术

关于分子杂交技术第一节分子杂交的原理核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链

第2页,共50页，2024年2月25日，星期天不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短（如20～30个核苷酸），则难免会出现准确性差的假阳性现象。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。第3页,共50页，2024年2月25日，星期天杂交的双方：探针和要检测的核酸。将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。被检测的核酸：

克隆化的基因组DNA

提纯的

细胞总DNA

细胞内杂交（细胞原位杂交）

细胞总RNA第4页,共50页，2024年2月25日，星期天变性复性

DNA-DNA杂交双链分子第5页,共50页，2024年2月25日，星期天杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。第6页,共50页，2024年2月25日，星期天一、DNA变性与复性（一）DNA变性

1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。第7页,共50页，2024年2月25日，星期天GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3第8页,共50页，2024年2月25日，星期天（二）复性

1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第9页,共50页，2024年2月25日，星期天2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子第10页,共50页，2024年2月25日，星期天二.分子杂交的一般程序

待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标记核酸探针电泳第11页,共50页，2024年2月25日，星期天制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。第12页,共50页，2024年2月25日，星期天三、

核酸探针的制备探针（Probe)的概念:

一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。第13页,共50页，2024年2月25日，星期天1.探针的制备方法长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。制备方法：

(1)DNA重组技术

(2)PCR扩增

(3)化学合成第14页,共50页，2024年2月25日，星期天2.探针的分类

据来源及性质不同可分为：

(1)基因组DNA探针

(2)cDNA探针

(3)RNA探针

(4)寡核苷酸探针第15页,共50页，2024年2月25日，星期天合成寡核苷酸探针注意原则(1)长度（10-50bp);(2)G:C对含量40%-60%；(3)探针内避免互补；(4)避免同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。第16页,共50页，2024年2月25日，星期天3.核酸探针的标记

为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。第17页,共50页，2024年2月25日，星期天

标记的种类

同位素：

32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素：生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物

第18页,共50页，2024年2月25日，星期天第二节核酸分子杂交的方法按其分子种类划分（1）Southern印迹杂交（2）Northern印迹杂交3）Western印迹杂交第19页,共50页，2024年2月25日，星期天按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交液相杂交

RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法第20页,共50页，2024年2月25日，星期天一、Southern杂交其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。

第21页,共50页，2024年2月25日，星期天步骤：酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。(2)将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。

(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。

(5)通过显影检查目的DNA所在的位置。

第22页,共50页，2024年2月25日，星期天带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程第23页,共50页，2024年2月25日，星期天（一）待测核酸样品的制备

1、裂解或破碎细胞

2、抽取纯化基因组DNA3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段第24页,共50页，2024年2月25日，星期天（二）待测DNA样品的电泳分离所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子量DNA也能显影出条带。第25页,共50页，2024年2月25日，星期天

（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）

分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（DNA产生缺口将提高转移的质量）。把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植物基因组DNA≤20分钟。再

把凝胶浸在灭菌双蒸水中第26页,共50页，2024年2月25日，星期天如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤(1)把凝胶浸在变性液（0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl）中，室温2×15分钟，轻轻晃动。(2)把凝胶浸在灭菌双蒸水中(3)把凝胶浸在中和液中（0.5mol/LTris-HCl，Ph7.5，1.5mol/LNaCl），室温2×15分钟。(4)在20×SSC中平衡凝胶至少10分钟。第27页,共50页，2024年2月25日，星期天（四）Southern印迹高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜（尼龙膜也较长用）上，烘干固定后即可用于杂交本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)第28页,共50页，2024年2月25日，星期天（1）毛细管虹吸印迹法

利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上第29页,共50页，2024年2月25日，星期天第30页,共50页，2024年2月25日，星期天白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水纸玻璃板重物吸水纸转膜第31页,共50页，2024年2月25日，星期天优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱第32页,共50页，2024年2月25日，星期天（2）真空转移法

此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。第33页,共50页，2024年2月25日，星期天第34页,共50页，2024年2月25日，星期天优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。

第35页,共50页，2024年2月25日，星期天（3）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。第36页,共50页，2024年2月25日，星期天（五）Southern杂交1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点

将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。第37页,共50页，2024年2月25日，星期天预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点第38页,共50页，2024年2月25日，星期天2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA，即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。杂交过夜（至少18h），然后在较高温度下用盐溶液洗膜。

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3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。第40页,共50页，2024年2月25日，星期天（六）杂交结果检测

1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中。将2张X光底片放入曝光暗盒，（二）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。（三）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。

2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针第41页,共50页，2024年2月25日，星期天Southern杂交能否检出杂交信号取决于：目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后,Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32P标记的高比活性探针的(>109cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。

第42页,共50页，2024年2月25日，星期天（七）Southern杂交在医学中的应用

1、酶切图谱分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突变分析

4、限制性片段长度多态性的分析第43页,共50页，2024年2月25日，星期天二、Northern印迹杂交原理：Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。第44页,共50页，2024年2月25日，星期天

1、鉴别RNA2、探针可用DNA或RNA片段

3、待测样品为总RNA或mRNA第45页,共50页，2024年2月25日，星期天Northern印迹与Southern印迹的不同点1.总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；

2、变性：RNA电泳前加热变性，电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完