干细胞研究方法及进展

关于干细胞研究方法及进展第一部分干细胞的概念第2页,共161页，2024年2月25日，星期天人体并不是由一种细胞构成，而是由２００多种细胞构成的，例如神经细胞、皮肤细胞等等。不同的细胞担负着不同的功能，但是所有这些细胞，都是由一个细胞—受精卵发育而来的。“全能性”的受精卵在发育过程中，不仅不断地分裂使细胞的数目增加，而且还不断地分化使细胞的种类增加。所谓“干细胞”，就是指那些未分化、因而有可能分化成不同类型细胞的细胞。

第3页,共161页，2024年2月25日，星期天干细胞的概念及分类

干细胞（Stemcell）:

指存在于胚胎直至成体的具有增殖、自我更新（self-renewal）以及分化潜能的原始细胞。第4页,共161页，2024年2月25日，星期天所有的干细胞都具有两个最为显著的特征：一是不断增殖、自我更新;二是在适宜的环境条件下可分化并产生不同类型的细胞。第5页,共161页，2024年2月25日，星期天分类(按分化潜能分类）全能干细胞（totipotentstemcells）、多能干细胞（pluripotentstemcell）单能干细胞（monopotentstemcell）或称为专能干细胞（committedstemcell）。第6页,共161页，2024年2月25日，星期天哺乳类胚胎卵裂第7页,共161页，2024年2月25日，星期天Fromeggtoblastocyte(human)第8页,共161页，2024年2月25日，星期天

全能干细胞是指能发育成为一个完整个体的原始细胞。受精卵、人体8细胞以前的胚胎每一个卵裂球都能发育成为一个完整个体，是全能干细胞。第9页,共161页，2024年2月25日，星期天

多能干细胞是指那些分化潜能很“宽”，可分化为多种类型细胞的原始细胞.如胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）、胚胎生殖细胞（embryonicgermcell）、骨髓基质干细胞（Bonemarrowstromalstemcell）、神经干细胞.第10页,共161页，2024年2月25日，星期天

单能干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型细胞分化，如表皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫肌卫星细胞（satellitecell），神经元干细胞只能分化为神经元，胶质干细胞只能分化为胶质细胞等。第11页,共161页，2024年2月25日，星期天按照生存阶段分类：

胚胎干细胞成体干细胞（adultstemcell；somaticstemcells），也称为组织干细胞（tissuestemcells）。第12页,共161页，2024年2月25日，星期天

胚胎干细胞，是存在于早期胚胎组织中，具有高度增殖能力和多向分化潜能，能分化为三个胚层所有细胞类型的原始细胞。

第13页,共161页，2024年2月25日，星期天

第14页,共161页，2024年2月25日，星期天Allofthebodytissuesarefromthe

inner

cellmass(内细胞团)Blastocyste(胚泡)Innercellmass(内细胞团)第15页,共161页，2024年2月25日，星期天ES细胞的建系第16页,共161页，2024年2月25日，星期天

第17页,共161页，2024年2月25日，星期天成体干细胞指存在于各组织器官的未分化细胞。在体内，它们具有终生自我更新（self-renewal）能力和分化潜能。第18页,共161页，2024年2月25日，星期天

根据胚胎干细胞来源不同，分为：ES细胞（embryonicstemcells）,来自囊胚期的内细胞团。EC细胞(embryoniccarcinomacells)，由畸胎癌（teratocarcinorma)中分离、筛选出的具有增殖，自我更新能力的细胞。EG细胞（embryonicgermcells)，由原始生殖细胞（primordialgermcells)中分离获得。第19页,共161页，2024年2月25日，星期天第20页,共161页，2024年2月25日，星期天EScellsEGcellsCarcinomacells第21页,共161页，2024年2月25日，星期天成体干细胞根据来源分为：骨髓干细胞

神经干细胞上皮干细胞肝干细胞胰腺干细胞皮肤干细胞脂肪干细胞第22页,共161页，2024年2月25日，星期天

成体干细胞具有可塑性（plasticity）或横向分化的特性。这是指某种组织的成体干细胞可分化为另一种组织的特异细胞的能力。例如骨髓基质干细胞可分化为心肌细胞、脂肪细胞等.

第23页,共161页，2024年2月25日，星期天造血细胞和骨髓基质细胞的分化第24页,共161页，2024年2月25日，星期天已知的成体干细胞第25页,共161页，2024年2月25日，星期天第二部分干细胞的基本特性

第26页,共161页，2024年2月25日，星期天一、干细胞的基本特征（一）干细胞的形态和生化特征(二)干细胞的生物学特征二、干细胞生存的微环境三、干细胞的命运四、世界各国对于干细胞研究的政策第27页,共161页，2024年2月25日，星期天一、干细胞的基本特征（一）干细胞的形态和生化特征1．形态特征：干细胞通常呈圆形或椭圆形，体积较小，核质比较大，胞内细胞器稀少，细胞内RNA含量低。根据其形态学特征和存在位置、分子标记可以辨认不同的干细胞，目前有的干细胞位置已经确定。例如神经干细胞主要分布于室下带、海马、纹状体、嗅球等区域。第28页,共161页，2024年2月25日，星期天2．生化特征：不同的干细胞具有不同的生化标志，如角蛋白15是确定毛囊中表皮干细胞的标志分子，nestin为神经干细胞的标志分子。利用标志分子确定干细胞位置、寻找和分离干细胞有重要意义。干细胞都具有较高的端粒酶活性，这与其增殖能力密切相关。第29页,共161页，2024年2月25日，星期天(二)干细胞的生物学特征1．干细胞的自我更新特征干细胞在体内终生都具有自我更新能力，这与祖细胞（具有优先更新能力）不同。其自我更新能力是通过不对称分裂(asymmetrydivision)和对称分裂(symmetrydivision)这两种形式实现的。第30页,共161页，2024年2月25日，星期天对称分裂如果产生的两个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞，称为对称分裂。不对称分裂如果产生一个子代干细胞和一个子代分化细胞则称为不对称分裂。第31页,共161页，2024年2月25日，星期天2．细胞的增殖特征1）干细胞增殖的缓慢性一般情况下,干细胞处于休眠或缓慢增殖状态,当其接受刺激,分化时，首先要经过一个短暂的增殖期，产生过渡放大细胞(transitamplifyingcell)或称为“短暂扩充细胞”,经若干次分裂后产生分化细胞。过渡放大细胞的作用是可以通过较少干细胞产生较多的分化细胞,同时保护干细胞。

第32页,共161页，2024年2月25日，星期天2）干细胞增殖的自稳定性自我维持(self-maintenance)或自稳定性是指干细胞可以在生物个体生命区间自我更新并维持其自身数目相对恒定性，这也是干细胞的基本特征之一。第33页,共161页，2024年2月25日，星期天维持自我稳定性是通过多种形式来实现。首先，当干细胞分裂时，无脊椎动物的干细胞常以不对称分裂来维持自身数目的恒定。哺乳动物的干细胞常常以对称分裂和不对称分列这两种形式进行，但对于群体而言仍然是不对称分裂。通过这两种分裂方式协调，保证干细胞数目相对衡定，同时更适应组织再生的需要。第34页,共161页，2024年2月25日，星期天第35页,共161页，2024年2月25日，星期天

3．干细胞的分化特征1）干细胞的分化潜能干细胞的分化具有多潜能性，但不同的干细胞具有的分化潜能不同。

2）干细胞的转分化和去分化一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞，称为干细胞的转分化(transdifferentiation)或横向分化。

第36页,共161页，2024年2月25日，星期天

二、干细胞生存的微环境

干细胞在机体组织中的居所称为干细胞巢(stemcellniche)。在干细胞巢中所有控制干细胞增殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境。干细胞是处于静息、休眠状态，还是处于分化状态，如处于分化状态，又分化为何种类型的细胞，这主要由干细胞本身状态和所处的微环境所决定。

第37页,共161页，2024年2月25日，星期天在干细胞的微环境中，对干细胞影响最大的主要包括以下三个方面：（一）分泌因子（二）细胞间相互作用（三）胞外基质第38页,共161页，2024年2月25日，星期天三、干细胞的命运一般生理情况下处于静止的G0期分裂的干细胞有5种发育途径：自我更新、分化、程序性死亡、迁移和进入休眠期，少数干细胞可以转分化。第39页,共161页，2024年2月25日，星期天四、世界各国对于干细胞研究的政策

第40页,共161页，2024年2月25日，星期天英国：

2001年1月，英国在经过了包括科学界、宗教界、企业界、政界等人士，以及普通老百姓参与的、长达3年的争论后，第一个将克隆研究合法化，允许科学家培养克隆胚胎以进行干细胞研究，并将这一研究定性为“治疗性克隆”。科学家可破坏被生育诊所废弃的胚胎用于干细胞和其他研究，也可通过试管内受精培养研究用胚胎。2002年，伦敦大学国王学院干细胞生物学实验室主任斯蒂芬明格的研究小组获得英国人工授精与胚胎学管理局颁发的两份研究人类胚胎干细胞衍生许可证之一。之后，成功建立了英国第一个人体胚胎干细胞系。

第41页,共161页，2024年2月25日，星期天2004年，英国成立了世界第一家政府性干细胞银行，该银行包括两个“存储”人类胚胎细胞的分支机构。它们分别是英国的国王学院和纽卡斯尔的生命研究中心；布莱尔政府对干细胞研究也表示强烈支持，希望借此保障英国生物技术在欧洲的领先地位。此外，英国成功创建了英格兰东部地区干细胞网络，以加强该地区干细胞研究相关的学术、临床与商业机构的协作，促进干细胞研究的创新及其应用，并使该地区成为未来干细胞产业发展的领导区域。第42页,共161页，2024年2月25日，星期天2005年3月，英国时任首相布莱尔宣布在3年内向包括干细胞研究在内的生物技术领域投资10亿英镑（约合19.2亿美元），以维持英国在国际生物技术界的优势地位。同月，英国时任财政大臣戈登·布朗宣布，政府将在其10年发展计划中建立一个全国性的干细胞研究网络，以巩固英国在该领域的领先地位；培育出克隆羊“多利”的英国科学家伊恩·威尔莫特也将研究重点转移到了干细胞研究领域。第43页,共161页，2024年2月25日，星期天2008年10月，英国议会下院以355票对129票的压倒性多数票通过《人工授精与胚胎学法案》，允许以医学研究为目的的人兽胚胎研究。这是首次表决通过完整的法案草案，意味英国20年来备受争议的人兽胚胎研究有望首次获得明确法律支持。这一法案的通过有利于英国奠定干细胞研究和无性繁殖领域的优势地位。此前的4月，纽卡斯尔大学科学家4月初宣布，用人体皮肤细胞的细胞核和剔除了遗传信息的牛卵细胞，成功培育出英国首个人与动物的混合胚胎。这一胚胎存活3天，被用于医学研究。第44页,共161页，2024年2月25日，星期天

美国

美国总统布什于2001年8月4日宣布政府批准用政府经费进行人体胚胎干细胞的研究，但是只能用于资助已有的人类胚胎干细胞系的研究，不资助开发和利用新的人类胚胎干细胞系。据说现在已有６０多个人类胚胎干细胞系，可以无限传代，足够科学家们研究了。第45页,共161页，2024年2月25日，星期天在干细胞研究方面，美国一直处于世界领先地位。从最初的骨髓移植算起，干细胞研究在美国已有30多年的历史。尤其是上世纪90年代末期，美国科学家成功实现人类胚胎干细胞在体外的生长和增殖，从而掀起了全世界干细胞工程研究的热潮。第46页,共161页，2024年2月25日，星期天长期以来，美国一些宗教界和保守派人士以有关实验可能破坏人类胚胎为由极力阻碍干细胞研究。2001年，布什下令禁止联邦基金资助针对从人类胚胎中取得新的干细胞株的有关研究，只允许对其他21种干细胞株进行研究。他还多次对国会支持干细胞研究的相关立法行使否决权。第47页,共161页，2024年2月25日，星期天奥巴马3月9日在白宫签署命令，解除对于用政府经费资助人类胚胎干细胞研究的限制。奥巴马说，作为一个有信仰的人，我相信人类应该尽其所能解除病人的痛苦。奥巴马此举将使国家卫生总署得以考虑向科学家提供用于研究数百种干细胞株的经费。有关人士表示，此举将有助于加快美国干细胞的研究步伐，从而早日为饱受糖尿病、帕金森综合征等疑难病困扰的患者带来福音。

第48页,共161页，2024年2月25日，星期天德国：德国联邦议院于2001年1月30日通过法案，允许德国科学家在严格限制的条件下利用进口的胚胎干细胞进行研究

第49页,共161页，2024年2月25日，星期天德国总理施罗德表示德国可以从邻国进口那些“在本国已被禁止，但邻国依然允许”的东西。德国卫生部长菲舍尔也立即表态，说德国可以进口胚胎人类干细胞进行科学研究。这意味着一个让人啼笑皆非的局面——强烈反对英国克隆胚胎提取干细胞的德国将从英国人手中购买干细胞！

第50页,共161页，2024年2月25日，星期天加拿大：加拿大卫生研究院于2001年3月4日公布对人类ES细胞研究实行“有限资助”的指导原则，包括对利用医疗机构“剩余”的人类胚胎进行干细胞的研究将提供资助，但是禁止政府资助在实验室里进行纯粹用于研究人类胚胎或者人类胚胎克隆的研究。

第51页,共161页，2024年2月25日，星期天日本：

日本在2000年度启动的“千年世纪工程”中，把干细胞工程作为四大重点之一，并把干细胞技术的出现视为生命科学和生物技术领域超过欧美的决好机遇。第52页,共161页，2024年2月25日，星期天韩国2005年5月19日，干细胞研究和克隆技术的领军人物、韩国汉城大学教授黄禹锡的实验室宣布成功克隆出世界上首批与病人基因相符的胚胎干细胞系，这一成果被视为人类胚胎干细胞研究的重大突破。

第53页,共161页，2024年2月25日，星期天

韩国科学家黄禹锡在干细胞研究领域取得突破性进展

第54页,共161页，2024年2月25日，星期天

黄禹锡说，我们的下一目标是研究如何让干细胞发展为器官的一部分。这并不是短时间内就能够达成的，因此，现在要做的就是踏踏实实地分阶段进行研究。我们将同韩国、美国、欧洲、中国和日本等其它研究小组紧密合作，为使克隆技术早日实现实用化而努力。

第55页,共161页，2024年2月25日，星期天黄禹锡认为，对于我们的技术会被利用于复制人类的疑心是没有根据的，我们所研究的是治疗性克隆，是为了制造能够用于治疗的细胞，而不是复制人类的生殖性克隆，这两种技术存在本质不同。不要说别人偷走我们的技术，就是我自己现在想克隆人我都不会，技术上是不行的。那些说已经克隆出人类的，都是谎话。

第56页,共161页，2024年2月25日，星期天黄禹锡教授表示：“从阿富汗猎犬种公狗身上提取体细胞，将其与被除去细胞核的其他狗的卵子结合在一起，我们用这种‘体细胞核替换法’制造了克隆受精卵。然后，把该受精卵移植到代理母体内，结果母狗于今年4月24日诞下小狗，小狗的遗传特征与提供体细胞的公狗完全相同。”

第57页,共161页，2024年2月25日，星期天此前以克隆羊多莉为开始，人们用体细胞核替换法克隆出老鼠、牛、猪、猫等10多种哺乳动物，但是由于狗的卵子较为奇特，在克隆技术上的瓶颈一直未能突破。其他动物在卵巢中能够轻易提取出成熟的卵子，但是狗在排卵时出现的是未成熟的卵子，因此无法马上用在克隆上。

第58页,共161页，2024年2月25日，星期天黄禹锡表示：“我们正确掌握未成熟的卵子在体内逐渐成熟的场所和时期，在提取适合于克隆的卵子上获得了成功。通过在动物克隆的最大难关——狗克隆上取得成功，我们研究组积累了在动物克隆上最高的知识经验。”

第59页,共161页，2024年2月25日，星期天美国《科学》杂志１１日宣布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细胞。

第60页,共161页，2024年2月25日，星期天汉城国立大学和美国密歇根州立大学等机构的科学家参与了这项研究。１６名健康妇女为这项研究志愿捐献了２４２个卵细胞以及被称为卵丘细胞的体细胞。科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用化学手段刺激卵细胞分裂，共有３０个克隆细胞经过约７天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被称为胚囊的早期胚胎阶段。第61页,共161页，2024年2月25日，星期天科学家们从这些胚囊中分离出２０个内层细胞团，并在此基础上最终获得一个人类胚胎干细胞系。实验显示，利用这种办法获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。

第62页,共161页，2024年2月25日，星期天

第63页,共161页，2024年2月25日，星期天韩国研究人员表示，新成果给治疗性克隆的应用“打开了大门”。《科学》杂志总编肯尼迪评论说，新成果确实令人鼓舞，但也应该认识到，胚胎干细胞技术可能还需几年才能真正投入应用。

第64页,共161页，2024年2月25日，星期天此前，美国先进细胞技术公司曾宣布克隆出含十几个细胞的人类早期胚胎，但一直未在学术刊物上发表成果。而其他研究人员进行的人类胚胎克隆和猴子克隆实验基本未获成功，一些科学家甚至认为现有克隆技术无法应用于灵长类动物。韩、美科学家指出，新成果证明，利用来自活体的体细胞克隆人类早期胚胎并从中获取干细胞是可行的。

第65页,共161页，2024年2月25日，星期天2004年2月,黄禹锡研究小组在美国《科学》杂志上发表论文,声称成功通过人类体细胞克隆早期胚胎而提取了干细胞,为世界首例。2005年5月,他的研究小组又在《科学》杂志上发表论文,声称培育出与患者的基因相匹配的胚胎干细胞,这被认为是在治疗疑难病症方面取得的突破性进展,因而引起国际科学界的轰动,也给韩国带来巨大荣誉。第66页,共161页，2024年2月25日，星期天但是,对黄禹锡研究成果的疑问接踵而来。先是黄禹锡违反科学伦理道德,使用该研究组研究员提供的卵子,并隐瞒获取卵子数量的行为被揭发;接着,人们又对黄禹锡2005年发表在《科学》杂志上的论文的真实性提出质疑。黄禹锡则坚称有人调换了他培育出的与患者基因相匹配的胚胎干细胞,并声称他掌握了胚胎干细胞的核心技术,要求调查委员会对他的研究成果进行重新验证。

第67页,共161页，2024年2月25日，星期天尽管否定了黄禹锡两篇论文，但调查委员会承认，全球首条克隆狗“斯纳皮”确系黄禹锡科研成果。这或许是调查报告唯一能令黄禹锡感到欣慰的一点。

调查委员会说,黄禹锡领导的科研小组能克隆出“斯纳皮”,说明他们的确掌握了一定技巧,但是这项技术在克隆技术方面并不突出。郑明熙说:“他们掌握的只是基础技术,毕竟他们没有培育出与患者DNA匹配的胚胎干细胞系。

第68页,共161页，2024年2月25日，星期天2007年11月14日，英国著名的科学刊物《自然》周刊在其网站上发表了一篇来自美国的科学论文，不声不响地爆出了一条为全球瞩目的科学消息：美国科学家率先克隆出了人类的灵长动物表兄弟猴子的早期胚胎。这意味着自克隆羊多利降生以来就令世人无限遐想的克隆人，已经离我们越来越近了。第69页,共161页，2024年2月25日，星期天这不由得令人又要想起韩国的克隆英雄黄禹锡。根据2006年1月10日首尔大学调查委员会公布的最终调查结果，虽然认定黄禹锡2004年与2005年发表在美国《科学》周刊上的有关治疗性克隆的干细胞研究成果属于造假，但对他培育出首例克隆狗的实验结果，科学界仍然没有否认。

第70页,共161页，2024年2月25日，星期天但仅仅就在一年多时间之后的2007年8月2日，美国《时代》周刊科学专栏对当天发表在《细胞干细胞》（CellStemCell）杂志的一篇论文，发出了及时的科学报道和评论：黄禹锡事件获得意外进展。《时代》周刊的美籍韩裔专栏记者爱丽丝·朴（AlicePark）一直在跟踪报道该事件。《细胞干细胞》是顶级生物学杂志《细胞》2007年才创办的子刊，也是国际干细胞学会的会刊。

第71页,共161页，2024年2月25日，星期天这一次，由哈佛大学教授达利（G.Daley）领衔的研究团队在《细胞干细胞》杂志上的文章表明：2004年黄禹锡博士发表在《科学》上的成果，已被他们确认，黄禹锡建立干细胞系的方法很可能是一项历史性的创举。达利教授表示，他们研究了黄禹锡论文中报道的那些干细胞系，发现其中有些不是来源于核移植体细胞克隆，而是通过另一条“单性生殖”技术路线产生的，也就是说是通过对未受精的卵细胞进行单性培育得到的，它们的细胞遗传特性与卵子提供者的细胞一致，与通过治疗性克隆得到的干细胞一样，可用于对供体的细胞移植。达利教授等人的论文正式确认了这一获取干细胞的新方法。第72页,共161页，2024年2月25日，星期天达利教授在自己的论文发表后曾不无惋惜地对记者表示，2005年，巅峰时期的黄禹锡还没来得及认识到自己科研内容的价值，就已被搞得焦头烂额，根本无法顾及科研数据的分析，制定下一步科研方向。而同时，许多西方学者却已经看到了一丝曙光。黄禹锡没有想到，自己的干细胞竟然是卵子单性生殖的结果。只要在当时认识并报道了单性生殖获取干细胞的成果，他的工作将遥遥领先，因为这是区别于体细胞克隆的一条全新的获取干细胞的技术路线。

第73页,共161页，2024年2月25日，星期天中国

我国在干细胞研究方面已经取得了和世界同步的发展。北京大学、中国协和医科大学、军事医学科学院、上二医和四川大学等高等院校和科研单位相继成立了专门的干细胞研究机构。2000年10月，国家干细胞基因工程产业化基地正式在天津华苑产业园区落成，将建设成为我国最大的干细胞库、干细胞移植中心以及相关科研用基地及产业化基地。

第74页,共161页，2024年2月25日，星期天

北京大学干细胞研究中心李凌松教授指出，人们开始尝试用干细胞技术治疗某些疾病仅仅只是开始,采用细胞技术治疗疾病大概至少要经历三个阶段：

第75页,共161页，2024年2月25日，星期天1.把一种组织的成体干细胞直接移植给相应组织损伤的病人以期治疗疾病。

第76页,共161页，2024年2月25日，星期天2.如果掌握了干细胞向某种组织细胞分化的条件，就可以在体外对干细胞进行诱导使之“定向”分化成所需的细胞；对于某些遗传性疾病，还可对干细胞进行基因修饰。对经过“定向分化”或“基因修饰”后的干细胞进行筛选后，把“合格”的细胞移植给病人。前两种方法都属于细胞替代或者顶多称其为“组织替代”，乐观地估计大概需要3～5年可以用于治疗糖尿病、帕金森氏症等。

第77页,共161页，2024年2月25日，星期天3.干细胞技术的理想阶段就是希望在体外进行“器官克隆”以供病人移植，虽然“器官克隆”的名词已不再陌生，但真正在体外形成一个具有空间结构和正常生理功能的人体器官，绝不是五、六年就能实现的，短期内这只不过是一个“美好的愿望”。

第78页,共161页，2024年2月25日，星期天我国卫生部对胚胎干细胞及克隆技术的研究的态度：

（一）我国不赞成、不支持、不允许、不接受任何生殖性克隆试验；（二）我国赞成以预防、治疗疾病为目的的人类胚胎干细胞研究，并使其在有效监控的条件下有序发展；

（三）我国应加强相关立法、促进克隆技术安全应用和健康发展。

第79页,共161页，2024年2月25日，星期天iPS细胞第80页,共161页，2024年2月25日，星期天就在人们还沉浸在对黄禹锡的惋惜中时，干细胞研究又产生了革命性的进展。2007年11月21日，《科学》周刊和《细胞》杂志在自己的网站上，同时报道了美国和日本科学家相似的创新——用类似调制基因鸡尾酒的方法，把几种基因一起导入细胞，获得了胚胎干细胞。这成为继体细胞克隆、单性繁殖之后的第三种方法。

第81页,共161页，2024年2月25日，星期天干细胞是一种“原初”类型的细胞，具有分化成各种组织细胞的潜能，成体身上的各种细胞都是早期胚胎中的原初细胞不断增殖和分化的结果。因此，一旦某些组织和器官出了问题，人们可以取出自己的体细胞，想办法让它们回复到胚胎时期的干细胞状态，再输入到病变组织，通过干细胞的增殖和分化重建病变组织，或在体外培养分化成实体器官再植入体内。因最初的来源就是自己的细胞，不会出现排异反应。

第82页,共161页，2024年2月25日，星期天不论是体细胞核移植还是单性繁殖，目的都是让成体细胞回复到未分化状态。这是一个发育逆转的过程。相对于这两种方法，那两组调酒师科学家的方法要简洁许多。他们从基因着手，各自选择了四种可以刺激细胞基因组使之回复到原初状态的“返老还童”基因，把它们组合调配在一起，导入逆转录病毒中。

第83页,共161页，2024年2月25日，星期天逆转录病毒是基因治疗中一种运载基因的工具，它可以像病毒感染细胞一样结合到细胞上，将携带的基因注入细胞。通过这个摆渡工具，那些具有调节作用的“返老还童”基因就进入了细胞，诱导细胞回复到原初状态。这其实也是一种“基因治疗”策略：一般的基因治疗是将具有治疗作用的基因导入细胞进行表达，而“鸡尾酒”方法导入的则是“返老还童”基因。

第84页,共161页，2024年2月25日，星期天干细胞是人体内可以转化为各种器官和组织的细胞，过去只能从胚胎中获得。2007年11月，美国和日本科学家分别宣布独立发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，得到的干细胞称为诱导多功能干细胞，又名iPS细胞。这一发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。第85页,共161页，2024年2月25日，星期天诱导性多功能干(inducedhumanpluripotentstem,iPS)细胞，也称诱导性多潜能干细胞。iPS是由一些多能遗传基因导入皮肤等受体细胞中制造而成，然后进一步进行体外诱导分化，得到理想的细胞模型。第86页,共161页，2024年2月25日，星期天诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）是利用病毒载体将四个转录因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类型。第87页,共161页，2024年2月25日，星期天Oct4

Oct4是POU家族的转录因子,维持细胞的多能性,是体细胞诱导为iPS细胞所必须的基因。在小鼠和人的ES细胞中,Oct4表达的抑制将会导致自发性分化为滋养层细胞。Niwa等实验结果表明,Oct-4能够维持ES细胞未分化状态并促进其增殖,并认为Oct-4的活化是重编程为多能干细胞的标志。第88页,共161页，2024年2月25日，星期天Sox2

Sox2是胚胎干细胞特异性转录因子,其与Oct-4一样均为体细胞重编程所必须的基因,除了可与Oct4协同调节维持细胞的多能性之外,还能促进干细胞向神经外胚层分化。第89页,共161页，2024年2月25日，星期天c-Myc和Klf4

c-Myc和Klf4不是iPS细胞形成所必须的基因,其作用是提高克隆形成的效率,当同时将二者去除时iPS细胞将不能生成,因此c-Myc和Klf4在iPS细胞产生的过程中同样重要。c-Myc是在人类癌细胞中发现的卟啉-原癌基因,尽管c-Myc可以提高iPS细胞克隆形成率,但其构建的嵌合体小鼠约20%发生了肿瘤。所以如果将iPS细胞用于临床治疗,c-Myc基因的转入必须慎重。Klf4即是抑癌基因又是原癌基因,一方面可以促进ES细胞的自我更新,另一方面在体细胞中强制表达可抑制DNA的复制,阻滞细胞周期于G1/S期,因此它在细胞增殖和分化之间起开关作用。第90页,共161页，2024年2月25日，星期天制造方法IPS细胞是由一些多能遗传基因导入皮肤等细胞中制造而成。在制造过程中，美国研究人员使用了4种遗传基因，同时加入了7种包括可阻碍特定蛋白质合成的物质和酶在内的化合物，以研究其各自的制造效率。研究结果显示，没有添加化合物时，遗传基因的导入效率为0.01％—0.05％，而加入了叫“巴尔普罗酸”的蛋白质合成阻碍剂之后，导入效率竟升至9.6％—14％。第91页,共161页，2024年2月25日，星期天如果从这4种遗传基因中排除导致细胞癌化的遗传基因，只使用3种基因，过去的导入效率只有0.001％甚至低，而加入“巴尔普罗酸”之后，其效率也提高了约50倍。研究人员认为，这很可能是因为“巴尔普罗酸”可以促进多能遗传基因的活性。今后，研究人员将就添加化合物是否会使遗传基因产生变异展开研究，以在提高制造效率的同时保证安全性。第92页,共161页，2024年2月25日，星期天

iPS细胞同样具有自我更新和分化的全能性，从日本科学家ShinyaYamanaka于2006年第一次发现这一技术到现在，科学家已经成功从小鼠，大鼠，猕猴，猪和人的体细胞中诱导并获得iPS细胞，而且诱导技术也产生了巨大的革新，减少外源转录因子，使用非整合病毒，质粒法等等都能够产生iPS细胞，最近，有报道称利用纯蛋白的方法也可以获得iPS细胞。第93页,共161页，2024年2月25日，星期天iPS技术具有巨大的潜在应用价值，利用iPS技术能够获得病人或者疾病特异的多能性干细胞，这样可以避免移植过程中的免疫排斥问题，也绕开了人类胚胎干细胞研究所带来的伦理问题。此外，掌握疾病特异性iPS细胞向相应疾病中的功能细胞定向诱导的技术方法，以此作为模型研究这些疾病的发病机制，利用以上疾病模型，对现有药物做出个体化的评估，并发现新的治疗靶点和筛选新的药物，将为这些重大性疾病的基础和临床研究开辟新的研究方法和技术平台。第94页,共161页，2024年2月25日，星期天但是关于人类诱导多能干细胞的研究还处于起步阶段，所采用的供体细胞还仅仅局限在人包皮成纤维细胞，表皮细胞，毛囊细胞等少数细胞类型，更为棘手的是，这些细胞被重编程为iPS细胞所需要的时间比较长（16-35天），效率很低，这大大增加了在这个过程中细胞的变异风险。因此如何找到一种理想的人类体细胞来源是所有科学家都重点关注的问题。第95页,共161页，2024年2月25日，星期天2008年４月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。第96页,共161页，2024年2月25日，星期天2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的iPS细胞培育出鼠角膜上皮细胞。第97页,共161页，2024年2月25日，星期天2009年3月伊始，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则在《细胞》杂志上宣布，他们可以将iPS细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证由此获得的神经元细胞的基本功能不受影响。第98页,共161页，2024年2月25日，星期天2009年7月，iPS细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据英国《自然》杂志网站23日报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了iPS细胞具有实用性。第99页,共161页，2024年2月25日，星期天2010年7月27日，日本京都大学iPS细胞研究所中川诚人讲师的研究小组发现，制取iPS细胞的转录基因中某一基因为易致癌基因，应用目前的技术克隆出的活体小鼠中一年后的死亡率为７０％，而其中有半数为得癌而死。该研究小组用一种结构相近的名为「Ｌ－Ｍｙｃ」的转录基因取代这一基因制取人体干细胞，得到的干细胞数量是之前的5倍，而且将这一技术应用于克隆活体小鼠实验发现，活体小鼠的死亡率降到了１０％。第100页,共161页，2024年2月25日，星期天2010年7月，巴西圣保罗大学医疗系的科研人员最近取得了利用改造皮肤基因获取诱导多功能干细胞（iPS细胞）的科研成果。科研人员在研究过程中使用了SOX2、C-MYC和另一匿名基因修改人类成人皮肤细胞，成功将其改造成了iPS细胞，并避免了肿瘤的产生。目前该研究小组正在继续努力以揭示出这些细胞拥有的其他特点以及其潜在的治疗功能。第101页,共161页，2024年2月25日，星期天当然，这种方法也有弊端：逆转录病毒这个运载工具毕竟是病毒，万一它们在细胞里进行病毒复制，可能诱发肿瘤。但是，基因发挥调节功能一般都是通过相关的化学小分子实现的，因此可以预期，以目前这个领域的发展速度，在不久的将来，科学家应该可以对这种方法进行改良：只需给细胞添加一些可诱导发育逆转的小分子药物，就能启动发育逆转的开关，得到人们自己的干细胞。第102页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞第103页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞体外培养原理

胚胎干细胞体外培养的原则是:在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。

第104页,共161页，2024年2月25日，星期天目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feederlayer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。第105页,共161页，2024年2月25日，星期天MEF和STO都能分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制胚胎干细胞自主分化的因子。MEF和STO培养上清中抑制胚胎干细胞自主分化因子--白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor；LIF）含量在500～1000IU/ml（分泌型）,同时在MEF和STO基质上还存在LIF（基质型）。第106页,共161页，2024年2月25日，星期天无饲养层培养法则是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或在基础培养基中加入重组的LIF制备成条件培养基。如果使用这样的条件培养基培养小鼠胚胎干细胞，可以不使用饲养层细胞，能保证小鼠胚胎干细胞增殖的同时维持未分化二倍体状态。第107页,共161页，2024年2月25日，星期天细胞可作为饲养层的细胞有二类:小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞。第108页,共161页，2024年2月25日，星期天饲养单层的制备一定剂量的丝裂霉素-C(mitomycin-C)和γ-射线能够使细胞停止分裂，但不至于马上死亡，可在体外存活一段时间，并保持分泌各种因子的功能。故使用丝裂霉素-C或γ-射线处理饲养细胞，使之终止分裂，同时仍分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制其自主分化的因子，维持其未分化二倍体状态。

第109页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞有饲养层培养

1）用丝裂霉素-C或γ－射线处理后的饲养细胞种植到预先用明胶处理的φ1cm的培养孔内，做成饲养单层。

2）将分散的胚胎内细胞团小块吸置饲养层上。一个内细胞团的细胞放置一个孔。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

第110页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎的准备和培养（1）母小鼠超数排卵

1）

性成熟前期母小鼠于中午12：00～1：00或下午5：00～6：00腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,每只小鼠5～10IU。

2）隔46～48hr腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），每只鼠5～10IU。同时以1：1比例与公鼠合笼。

3）第二天上午观察母小鼠阴道栓，见栓当天上午确定为怀孕0.5d，见栓第四天为怀孕3.5d。

第111页,共161页，2024年2月25日，星期天（2）胚胎采集

1）断颈处死怀孕3.5d的母小鼠,在无菌条件下打开腹腔,暴露子宫。

2）镊住近子宫颈端并剪断,分离子宫系膜,在输卵管端剪断子宫角。

3）

取出子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置入无菌平皿内。

第112页,共161页，2024年2月25日，星期天4）

用1ml无菌注射器吸入冲卵液。从子宫角端进针，保证针头进入子宫腔内，将冲卵液快速推入子宫腔。每侧子宫注入冲卵液0.2～0.5ml,冲卵液会将胚胎冲出。

5）将毛细吸管在火焰上拉细，并用砂轮断末端，制备吸卵针。

6）将盛有胚胎和冲卵液的平皿置于50～100倍的解剖显微镜下。用吸卵针收集胚胎。3.5d胚胎一般处于囊胚期，但也可能处于桑椹期，均可使用。第113页,共161页，2024年2月25日，星期天（3）胚胎培养

1）

取φ3.5cm平皿,用记号笔划分四等分。在每等分内加入胚胎干细胞培养液做成露滴状液滴,每个液滴直径为0.5～1cm。

2）向平皿内加入透明石蜡油，以能覆盖培养液滴为度。

3）将收集好的3.5d胚胎吸置培养液滴内。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每天半量换液一次。

第114页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的分离1）将囊腔充分扩展的胚胎移置到制备好的饲养单层上，换上胚胎干细胞培养液；或移置到无饲养层但加有条件培养基的液滴内（制备同前）。

2）继续培养。第一天胚胎突破透明带；48hr左右胚胎贴壁，滋胚层细胞舒展开并贴附着培养瓶（皿）表面生长，内细胞团（innercellmass，ICM）位于滋胚层细胞层的中央部位，向上隆起生长。

3）继续培养2～4d，内细胞团继续增大第115页,共161页，2024年2月25日，星期天4）将毛细吸管一端在火焰上拉细，用砂轮将末端切断。准备末端口径比内细胞团稍大和稍小两种。

5）

取φ3.5cm的平皿，在平皿内做消化液小滴。每个消化液小滴φ0.3～0.5cm。每个平皿可做20个消化液小滴。

第116页,共161页，2024年2月25日，星期天6）

将内细胞团生长良好的培养平皿置于解剖镜下或显微操作仪下，用50～100倍观察并完成7)～9)的操作步骤。

7）用末端口径比内细胞团块稍大的毛细吸管挑起内细胞团，吸置消化液小滴内。第117页,共161页，2024年2月25日，星期天8）将内细胞团吸至另一消化液小滴，在室温或37℃下作用约1～5min。改用末端口径比内细胞团小的毛细吸管，轻轻吸吹内细胞团块，使之分散至3～4个细胞在一起的小团块。

9）将分散的内细胞团小块吸至准备好的饲养单层上或条件培养基中进行培养（见后）。第118页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞无饲养层培养1）用0.1%明胶水溶液处理φ1cm的培养孔。

2）在培养孔内加入条件培养基，每孔1ml。

3）将分散的内细胞团小块吸置于培养孔内。一个内细胞团的细胞放置1个孔。

4）在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。

第119页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的获得获得途径主要有：从早期胚胎获得2.从原始生殖细胞获得3.从移植细胞(克隆细胞)获得第120页,共161页，2024年2月25日，星期天1．从早期胚胎获得美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞：体外受精卵→囊胚期→去除滋养层→内细胞团,得5株干细胞系32代(8个月)保持未分化状态。发育免疫切除法培养

传代第121页,共161页，2024年2月25日，星期天2．从原始生殖细胞获得gearhart小组：流产胎儿性腺嵴原始生殖细胞获得5个多能干细胞系7个月不分化。

思路：原始生殖细胞是未分化细胞。分离培养培养第122页,共161页，2024年2月25日，星期天3．体细胞移植分化细胞核(乳腺、皮肤细胞)去核卵细胞→杂合细胞发育成囊胚胚胎干细胞成体(如多利羊)。

移植刺激分离发育第123页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的主要特征第124页,共161页，2024年2月25日，星期天形态和生化特征1.形态：细胞体积小，核大，1~多个核仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。2.生化特征：端粒酶活性高。3.干细胞物理特性：如干细胞对Hoechst33324和Rhodamine123染料不着色。第125页,共161页，2024年2月25日，星期天4.

干细胞表面免疫原性：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原-1(SSEA-1)，不表达SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干细胞表达SSEA-3或SSEA-4。第126页,共161页，2024年2月25日，星期天干细胞的分离与纯化1.借助细胞的生化特征及物理特性，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。2.干细胞的理化特征与其分化调控有关，如上皮干细胞高表达β1整合素，介导干细胞与细胞外基质粘附，抑制干细胞分化。第127页,共161页，2024年2月25日，星期天胚胎干细胞的分化潜能胚胎干细胞是全能(多能)性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。移植实验:人胚胎干细胞小鼠体内畸胎瘤(良性)→有三个胚层产生的组织：胃上皮(内胚层)骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层)神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层)第128页,共161页，2024年2月25日，星期天骨髓干细胞第129页,共161页，2024年2月25日，星期天骨髓基质干细胞（MSC）的有关基础研究及应用现状

MSC具备干细胞的两个重要特征:强的自我增殖能力和多分化潜能。具有向骨、软骨、脂肪、肌肉(心肌)及神经细胞等组织分化的潜能。MSC起源于中胚层,理论上讲,它应可以向其它中胚层组织分化。第130页,共161页，2024年2月25日，星期天MSC的培养方法目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

第131页,共161页，2024年2月25日，星期天1999年,Pittenger等用地塞米松、β-甘油磷酸等在体外培养条件下将其诱导分化成骨组织;在培养体系中加入ＴＧＦ-3即可促使ＭＳＣ向软骨分化;用1-methyl-3-isobutylxanthine、地塞米松、胰岛素及消炎痛处理,可成功诱导分化为细胞内出现富集的脂质小泡的脂肪细胞。第132页,共161页，2024年2月25日，星期天Ｍakino等在小鼠骨髓细胞中加入5-azacytidine培养24ｈ,然后显微镜下分离能自发跳动的细胞克隆。分离的细胞再加入5-azacytidine培养24ｈ,筛选出自发跳动频率最高的细胞约占细胞总数的30%。电子显微镜下细胞类似于心肌细胞,包括典型的肌小节,位于细胞中央的细胞核,而且这些细胞能分泌心房利钠肽和脑利钠肽。应用单克隆抗体免疫组化的方法分析细胞的肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、肌动蛋白后发现这些细胞类似于胚胎心肌细胞。

第133页,共161页，2024年2月25日，星期天国内项鹏等首次用硫代甘油和丹参注射液诱导人ＭＳＣ分化为神经元样细胞,表达神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白。第134页,共161页，2024年2月25日，星期天近期研究表明，在适宜的体内或体外环境下MSC不仅可以分化为中胚层的间质组织，还保持有内外胚层的分化潜能，可分化为神经细胞、肺脏、上皮等。将MSC与胎鼠的中脑或纹状体细胞共同培养，它可分化为神经元和胶质细胞，而将MSC移植到心肌缺血坏死区周围，3周后渐与周围心肌细胞相似，并可见大量新生血管在新生心肌细胞周围，这些均表明MSC的分化趋势与周围微环境密切相关。因此有人推论MSC的分化由特殊转录因子决定，不同的诱导条件可以决定其分化方向，可能是这些诱导条件启动了决定分化方向的转录因子。第135页,共161页，2024年2月25日，星期天MSC的体外诱导分化亦印证了以上说法。Sanchez-Ramous发现表皮生长因子或脑源性神经营养因子可诱导人及小鼠的少数MSC分化为神经元样及神经胶质细胞。Deng等研究证明，用能提高细胞内cAMP浓度的诱导剂，如异丁甲基黄嘌呤、二丁酰基cAMP等处理后6d,大约25%的MSC定向分化为神经元样细胞，并且分化是不可逆的。第136页,共161页，2024年2月25日，星期天研究证明，MSCs在不同的体外环境诱导下可向不同组织分化。目前诱导分化的方法可大致分为两种：一是在化学药物作用下诱导MSCs进行分化；二是在不同细胞因子作用下诱导MSCs进行定向分化。第137页,共161页，2024年2月25日，星期天MSCs在体外分化研究中,已经发现能诱导MSCs分化为神经元的物质,包括一些抗氧化剂、神经营养因子和生长因子以及损伤或正常的神经组织匀浆上清液等。Woodbury等用二巯基乙醇(2-ME)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和丁化羟基苯甲醚(butylatedhydroxyanisole,BHA)等一些抗氧化的物质具有诱导MSCs分化为神经元作用,表达神经元特有的标记如NF、Neu、Tau和NSE等。第138页,共161页，2024年2月25日，星期天Sanchez-Ramos等使用了EGF或BDNF与视黄酸(retinoicacid,RA)等组合将MSCs诱导为神经元样细胞。这些抗氧化剂诱导MSCs分化的确切机制尚不清楚,可能与其抗氧化特性、提高神经元在体外的存活有关。第139页,共161页，2024年2月25日，星期天Jin等应用EGF、FGF-2、RA、NGF等不同组合,进行诱导MSCs分化,分化细胞形成神经元样突起,表达神经元标志物,但是,不同生长因子诱导所表达的标志物在细胞内的分布不同。Chen等发现,用创伤性脑损伤大鼠的脑提取物培养人的MSCs,则MSCs产生BDNF、NGF、VEGF、HGF显著增加。第140页,共161页，2024年2月25日，星期天创伤脑组织提取液可产生一些生长因子如bFGF、PDGF等。因此,认为这些神经营养因子能促进MSCs的自(旁)分泌作用,产生NGF、BDNF、M-CSF、VEGF、HGF等,从而作用于神经元的相应的受体,通过受体信号传导系统激活生存信号、失活死亡信号,并启动分化机制,且产生神经细胞保护作用。第141页,共161页，2024年2月25日，星期天MSCs在体内分化为神经细胞,其机制可能更为复杂。MSCs与宿主脑相互作用导致MSCs自分泌或旁分泌营养因子增加,可能有助于损伤神经功能的恢复。MSCs分泌巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)、干细胞因子、转化生长因子-β(TGF-β)等,还产生神经细胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule,N-CAM)和神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)等,这些细胞因子和神经营养因子是细胞得以存活、生长、分化的重要物质。第142页,共161页，2024年2月25日，星期天Mahmood等用脑源性神经营养因子(BDNF)或神经生长因子(NGF)进行对MSC体外培养,发现BDNF或NGF组比未用组在脑创伤鼠脑内存活MSC数量明显增多,神经功能恢复也明显高于未用组,移植存活的细胞表达NeuN、MAP-2和GFAP,可见BDNF或NGF等能促使MSCs向神经细胞分化。第143页,共161页，2024年2月25日，星期天MSC的移植途径：①直接侧脑室注射，经立体定位仪定位后进行侧脑室穿刺，将扩增的MSC移植于侧脑室，使之随脑脊液到达病变部位；②腰穿椎管内植入，将扩增的MSC移植入蛛网膜下腔，使之随脑脊液到达病变部位；③直接注射，符合外科适应证的患者，在开颅后将扩增的MSC直接注射到病变部位；④静脉移植，开放血脑屏障，