动物肝脏提取和鉴定实验技术

关于动物肝脏提取和鉴定实验技术核酸的分类

DNA(脱氧核糖核酸)

主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。

RNA（核糖核酸）

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。

除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。第2页,共22页，2024年2月25日，星期天核酸的理化性质在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来第3页,共22页，2024年2月25日，星期天

浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。

苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。基因组DNA的提取方法第4页,共22页，2024年2月25日，星期天

核酸制备中常用的去垢剂

核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。

去垢剂的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；

2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；

3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠第5页,共22页，2024年2月25日，星期天

作用：

1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。

2.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。

如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂第6页,共22页，2024年2月25日，星期天核酸制备中常用的酶

DNase:降解DNA

RNase：降解RNA

蛋白酶K：降解蛋白质溶菌酶：破碎细胞

第7页,共22页，2024年2月25日，星期天核酸提取的主要步骤沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤除去其它不需要的核酸分子破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）第8页,共22页，2024年2月25日，星期天注意事项加入RNA降解酶除RNA加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等蛋白变性剂反应不宜过于剧烈避免过酸、过碱及高温第9页,共22页，2024年2月25日，星期天一、实验目的：1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。第10页,共22页，2024年2月25日，星期天二、实验原理

核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。

DNA-Pro（DNP）细胞核RNA-Pro(RNP)核仁及细胞质溶于高盐溶液（1mol/L）,微溶于低盐溶液（0.14mol/L）溶于低盐溶液（0.14mol/L）微溶于高盐溶液（1mol/L）第11页,共22页，2024年2月25日，星期天

核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。

脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收。

DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。

第12页,共22页，2024年2月25日，星期天三、实验试剂95%冷乙醇、NaCl固体二苯胺：称取纯二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中，加入10ml过氯酸，混匀。临用时加1ml1.6%乙醛溶液，所配置试剂应为无色。0.14mol／LNaCl－0.05mol／L柠檬酸钠缓冲液(PH=6.8)DNA标准液200ug/ml:DNA钠盐用5mmol/L的NaOH配制。氯仿/异戊醇=20：1（V/V）5%SDS第13页,共22页，2024年2月25日，星期天组织捣碎匀浆机

第14页,共22页，2024年2月25日，星期天猪肝8g匀浆16ml的0.14mol／LNaCl－0.05mol／L

柠檬酸钠缓冲液离心，4000r/min,10min上清（弃掉）沉淀沉淀25ml缓冲液洗涤离心，4000r/min,20min上清（弃掉）40ml的0.14mol／LNaCl－0.05mol／L

柠檬酸钠缓冲液沉淀21ml氯仿/异戊醇4ml5%SDS振荡30min（保鲜膜封口）加入3.6gNaCl固体，终浓度为1mol/L离心，3500r/min,20min吸取上清（量取体积）95%冷乙醇（缓慢加入）边加边朝一个方向缓慢搅动DNA粗制品第15页,共22页，2024年2月25日，星期天第16页,共22页，2024年2月25日，星期天除去蛋白质的方法

SDS（十二烷基硫酸钠）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性氯仿一异成醇使蛋白质变性，离心除去变性蛋白质第17页,共22页，2024年2月25日，星期天DNA的定量测定第18页,共22页，2024年2月25日，星期天DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml，作为待测品。混匀，60℃水浴保温45min，冷却后，595nm处，比色。第19页,共22页，2024年2月25日，星期天以吸光度A595nm对DNA含量（ug）作图，绘制标准曲线。从标准曲线上查出样品的DNA含量。计算100g猪肝中DNA的含量：

待测样品中DNA的质量×25(稀释倍数)称取猪肝的质量=第20页,共22页，2024年2月25日，星期天匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。固体NaCl应磨碎，加入应分批缓慢加入，边加边摇，避免局部浓度过大或者未及溶解而沉入氯仿