基因重组和基因工程

关于基因重组和基因工程

掌握：基因重组和基因工程的概念，细菌基因转移的接合作用、转化作用和转导作用，DNA克隆、限制性核酸内切酶、基因载体、cDNA文库、基因组DNA文库的概念，目的基因的来源，基因载体的类型，重组DNA技术的操作程序。熟悉：同源重组、特异位点的基因重组、转座重组的概念和基本过程，重组DNA技术的操作步骤。了解：重组DNA技术与医学的关系。目的要求第2页,共126页，2024年2月25日，星期天基因重组(generecombination)

是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。基因工程(geneticengineering）

是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖和表达的过程。

基本概念第3页,共126页，2024年2月25日，星期天第一节

自然界DNA重组和基因转移是经常发生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequentlyinNature第4页,共126页，2024年2月25日，星期天DNA重组位点特异的重组(site-specificrecombination)转座重组(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)转导作用(transduction)同源重组(homologousrecombination)转化作用(transformation)第5页,共126页，2024年2月25日，星期天发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式第6页,共126页，2024年2月25日，星期天Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：第7页,共126页，2024年2月25日，星期天片段重组体（见模型图右边产物）：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体中间含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图左边产物）：

切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。

第8页,共126页，2024年2月25日，星期天

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´第9页,共126页，2024年2月25日，星期天Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体第10页,共126页，2024年2月25日，星期天Hollidayintermediate的电镜照片第11页,共126页，2024年2月25日，星期天二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。有四种方式：接合、转化、转导和细胞融合。第12页,共126页，2024年2月25日，星期天可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒第13页,共126页，2024年2月25日，星期天（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。第14页,共126页，2024年2月25日，星期天（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。第15页,共126页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)第16页,共126页，2024年2月25日，星期天三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。第17页,共126页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌体DNA的整合第18页,共126页，2024年2月25日，星期天

噬菌体的重组位点attP与大肠杆菌的重组位点attB之间有15bp核心序列相同，在整合酶（Int）、整合酶宿主因子（IHF）作用下发生整合；切除还需要Xis蛋白的参与。第19页,共126页，2024年2月25日，星期天（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。第20页,共126页，2024年2月25日，星期天沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。第21页,共126页，2024年2月25日，星期天（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(

和

)，一个编码重链。

轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLV

D

JC第22页,共126页，2024年2月25日，星期天重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段第23页,共126页，2024年2月25日，星期天V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程第24页,共126页，2024年2月25日，星期天四、转座重组大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。第25页,共126页，2024年2月25日，星期天

插入序列(insertionsequences,IS)组成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列二个反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因第26页,共126页，2024年2月25日，星期天插入序列发生转座的形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)

是插入序列从原位迁至新位。

是插入序列复制后，其中的一个复制本迁移至新位，另一个仍保留在原位。第27页,共126页，2024年2月25日，星期天插入序列的复制性转座第28页,共126页，2024年2月25日，星期天转座子(transposons)——从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因第29页,共126页，2024年2月25日，星期天

细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L第30页,共126页，2024年2月25日，星期天由转座子介导的转座第31页,共126页，2024年2月25日，星期天DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第二节重组DNA技术,又称DNA克隆或分子克隆第32页,共126页，2024年2月25日，星期天重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，应用重组DNA技术制造医学上重要药物。1980年建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。第33页,共126页，2024年2月25日，星期天

转基因猪进行人体器官移植由于猪的器官，如心脏与人的大小和活动能力类似，且猪的数量充足，容易繁殖，可以充分满足临床需要，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者。在人体器官移植手术中，灵长类猿猴的内脏普遍为人们所看好。但医学研究发现，猿猴身上的一些病毒对人类十分有害。第34页,共126页，2024年2月25日，星期天图：美国哈佛医学院的研究人员正将一头猪的肝脏取出来，为一位肝昏迷患者作替代肝脏。通过基因工程手段，将猪的一个能引发人体排斥反应的基因-GT基因被关闭，使猪的器官成功移植到人体内的可能性大大增加。

GT基因控制产生一种酶，这种酶使猪细胞表面产生一种蛋白质。当猪的器官移植进人体时，人类免疫系统能识别这种蛋白质，从而产生强烈的排异反应。第35页,共126页，2024年2月25日，星期天水母第36页,共126页，2024年2月25日，星期天利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病人对白蛋白的需求。第37页,共126页，2024年2月25日，星期天返回把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。第38页,共126页，2024年2月25日，星期天转基因抗冻西红柿

transgenicanti-chillingtomatoes转鱼基因番茄是将美洲拟蝶鱼的抗寒基因转入番茄的染色体上，该品种具有耐寒（植株的致死温度下降2℃）、高产（产量增加18％以上）、优质（果实维生素C含量增加15．5％）、抗病等优点。第39页,共126页，2024年2月25日，星期天延熟保鲜的转基因番茄转基因

（transgenicanti-ageingtomatoes）通过反义技术，封闭乙烯合成酶（ACC）基因的表达，没有基因产物.第40页,共126页，2024年2月25日，星期天转抗虫基因Bt烟草植株的抗虫效果第41页,共126页，2024年2月25日，星期天Goldenrice（黄金米）vitaminA=retinol-producedbyanimalsinliver,milkandeggsplantsdonotproducevitA-butsomeproduceß-carotene,aprecursorforvitAincluding“yellowvegetables”,yellowendospermcornandsorghuminmanydevelopingcountries,vitAdeficiencyisamajorproblem:第42页,共126页，2024年2月25日，星期天基因工程与药物研制我国生产的部分基因

工程疫苗和药物许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。第43页,共126页，2024年2月25日，星期天胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!第44页,共126页，2024年2月25日，星期天第45页,共126页，2024年2月25日，星期天环境保护基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。第46页,共126页，2024年2月25日，星期天

利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。第47页,共126页，2024年2月25日，星期天相关概念

DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理及操作步骤本节主要内容：第48页,共126页，2024年2月25日，星期天一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆第49页,共126页，2024年2月25日，星期天应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆第50页,共126页，2024年2月25日，星期天

目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。第51页,共126页，2024年2月25日，星期天（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶多聚核苷酸激酶

碱性磷酸酶

末端转移酶基因工程的手术刀！第52页,共126页，2024年2月25日，星期天重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第53页,共126页，2024年2月25日，星期天限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点切割双链DNA的一类内切酶。存在细菌体内。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+定义：第54页,共126页，2024年2月25日，星期天与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）分类：1800+种作用：

例如：EcoRI、BamHI等就属于这类酶。第55页,共126页，2024年2月25日，星期天第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第56页,共126页，2024年2月25日，星期天Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第57页,共126页，2024年2月25日，星期天BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第58页,共126页，2024年2月25日，星期天来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：第59页,共126页，2024年2月25日，星期天有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶第60页,共126页，2024年2月25日，星期天名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割点切割后产生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后产生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后产生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性内切核酸酶第61页,共126页，2024年2月25日，星期天（三）目的基因(targetgene)cDNA(complementaryDNA)

指经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA(genomicDNA)

指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。第62页,共126页，2024年2月25日，星期天（四）基因载体

定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些DNA分子。

载体按功能分为

克隆载体(cloningvector)

表达载体(expressionvector)第63页,共126页，2024年2月25日，星期天克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。第64页,共126页，2024年2月25日，星期天

常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA第65页,共126页，2024年2月25日，星期天载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。第66页,共126页，2024年2月25日，星期天1.质粒(plasmid):特点:

能在宿主细胞内自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。

是存在于细菌染色体外的具有自主复制能力的小型环状双链DNA分子。第67页,共126页，2024年2月25日，星期天最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切位点。

第68页,共126页，2024年2月25日，星期天第69页,共126页，2024年2月25日，星期天第70页,共126页，2024年2月25日，星期天2.噬菌体(bacteriophage，phage)噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。

噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。

第71页,共126页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型载体，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型载体，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列第72页,共126页，2024年2月25日，星期天

由λ噬菌体的cos区与pBR322质粒组合的杂种载体。粘粒可克隆29-45kb的大片段，常用作建立真核基因组文库的载体。

粘粒(cosmid)第73页,共126页，2024年2月25日，星期天

3.病毒（virus）

病毒载体更多用于真核表达系统，如腺病毒，腺病毒相关病毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空泡病毒等。第74页,共126页，2024年2月25日，星期天

酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)

细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)4.其他第75页,共126页，2024年2月25日，星期天二、重组DNA技术基本原理1.目的基因的获取2.克隆载体的选择和构建3.外源基因与载体的连接4.重组DNA导入受体细胞5.重组体的筛选6.克隆基因的表达第76页,共126页，2024年2月25日，星期天

以质粒为载体的DNA

克隆过程第77页,共126页，2024年2月25日，星期天（一）目的基因的获取化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应(PCR)第78页,共126页，2024年2月25日，星期天化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。第79页,共126页，2024年2月25日，星期天组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因第80页,共126页，2024年2月25日，星期天限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库第81页,共126页，2024年2月25日，星期天

将mRNA逆转录合成cDNA，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNA文库。从cDNA文库获取目的基因第82页,共126页，2024年2月25日，星期天mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT第83页,共126页，2024年2月25日，星期天（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。第84页,共126页，2024年2月25日，星期天（三）外源基因与载体的连接第85页,共126页，2024年2月25日，星期天

粘性末端连接方式：

(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接第86页,共126页，2024年2月25日，星期天BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+载体DNA用

BamHⅠ切割目的基因用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接第87页,共126页，2024年2月25日，星期天不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。第88页,共126页，2024年2月25日，星期天2.平端连接限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：第89页,共126页，2024年2月25日，星期天目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连第90页,共126页，2024年2月25日，星期天在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接第91页,共126页，2024年2月25日，星期天5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´第92页,共126页，2024年2月25日，星期天由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。4.人工接头(linker)连接第93页,共126页，2024年2月25日，星期天人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第94页,共126页，2024年2月25日，星期天受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌第95页,共126页，2024年2月25日，星期天1、显微注射法(Microinjectiontechnique)在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。第96页,共126页，2024年2月25日，星期天2、电穿孔法在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。方法适应不同细胞如细菌、酵母、植物及动物细胞。需电穿孔仪。第97页,共126页，2024年2月25日，星期天3、DNA-磷酸钙共沉淀法

将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。更换培养液使外源DNA在细胞中表达，筛选转化细胞或分析外源基因的表达量。第98页,共126页，2024年2月25日，星期天4、DEAE-右旋糖苷法

该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。通常只用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。它对BSC-1，CV-1和COS细胞转染较好，因此应用上有限制。第99页,共126页，2024年2月25日，星期天5、逆转录病毒载体逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。第100页,共126页，2024年2月25日，星期天1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法:原位杂交、Southern印迹等。2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选第101页,共126页，2024年2月25日，星期天(插入失活法)

抗药性标记选择带有双抗生素的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都生长，DNA重组体只能在其中一种抗生素培养基上生长。第102页,共126页，2024年2月25日，星期天组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救第103页,共126页，2024年2月25日，星期天

α互补原理筛选重组体pUC18

如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β–半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blueclony。如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β–半乳糖苷酶，产生whiteclony。第104页,共126页，2024年2月25日，星期天

原位杂交第105页,共126页，2024年2月25日，星期天Southern印迹第106页,共126页，2024年2月25日，星期天鸡的β肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法第107页,共126页，2024年2月25日，星期天重组DNA技术操作过程可形象归纳为：小结分分离目的基因

切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体细胞筛筛选重组体

第108页,共126页，2024年2月25日，星期天重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA

cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因

连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交第109页,共126页，2024年2月25日，星期天表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达第110页,共126页，2024年2月25日，星期天

标准：选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点

E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最常用)第111页,共126页，2024年2月25日，星期天大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 第112页,共126页，2024年2月25日，星期天第113页,共126页，2024年2月25日，星期天

优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA

可适当修饰表达的蛋白质表达产物分