仪器分析分子发光分析法

关于仪器分析分子发光分析法分子发光分析法较高激发态基态吸收能量受激退激光辐射分子在退激过程中以光辐射形式释放能量§5-1分子发光分析法及其分类第2页,共61页，2024年2月25日，星期天根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：光致发光：以光能来激发而发光

化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法热致发光、生物发光、电致发光荧光—荧光分析法磷光—磷光分析法第3页,共61页，2024年2月25日，星期天激发光谱和荧光光谱荧光强度波长（nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱Iλλex,maxλfl,max第4页,共61页，2024年2月25日，星期天硒荧光分光光度法GB17378.5-1998(13.1)油类沉积物荧光分光光度法GB17378.5-1998(14.1)石油烃荧光分光光度法GB17378.6-1998(14.1)第5页,共61页，2024年2月25日，星期天§5-2

荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光基态分子价电子跃迁到激发态光照激发去激发光*

*n基态第6页,共61页，2024年2月25日，星期天1.电子自旋状态的多重性分子中的电子数及自旋方向基态单重态S0第一激发单重态S1S0,S1,S2,S3分别代表基态、第一、二、三激发单重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8第7页,共61页，2024年2月25日，星期天T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态由基态单重态→激发三重态，净自旋

0。这种跃迁为禁阻跃迁基态单重态S0第一激发三重态T1自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-4~1S第8页,共61页，2024年2月25日，星期天2.无辐射去激外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换S-S系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T

发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内部转换困难第9页,共61页，2024年2月25日，星期天T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃第10页,共61页，2024年2月25日，星期天3.辐射去激—荧光和磷光产生S1或T1S0这种过程叫辐射去激发光(1)荧光：从S1的最低振动能级回到S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光第11页,共61页，2024年2月25日，星期天特点：产生速度快，10-9~10-6s；依赖于外部光源荧>激第12页,共61页，2024年2月25日，星期天T1S0ISCVRVRIC吸光吸光荧光图5-1分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃第13页,共61页，2024年2月25日，星期天（2）磷光S1T1S0磷光特点：发光速度慢，约为10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间体系间窜跃(isc)发光第14页,共61页，2024年2月25日，星期天磷光的波长更长

磷>

荧>

激

*易产生荧光

n*易产生磷光第15页,共61页，2024年2月25日，星期天T1S0ISCVRVRIC吸光吸光荧光

磷光图5-1分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫IC：内部转换ISC：系间窜跃VR第16页,共61页，2024年2月25日，星期天二、荧光、磷光与分子结构的关系（一）荧光效率

荧光强度常用荧光量子效率φf来描述

荧光量子效率

f=发荧光的分子数激发态分子总数第17页,共61页，2024年2月25日，星期天

f是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，

f

越大，荧光越强，在0~1之间。分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率大于0.1。第18页,共61页，2024年2月25日，星期天（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系物质只有吸收了紫外可见光，产生*、n*跃迁，产生荧光第19页,共61页，2024年2月25日，星期天*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103，寿命短*跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光第20页,共61页，2024年2月25日，星期天1.共轭体系——有较强的荧光具有共轭体系的芳环或杂环化合物,

电子共轭程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越大,产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强第21页,共61页，2024年2月25日，星期天

f

ex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长第22页,共61页，2024年2月25日，星期天

多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定

3,4-苯并芘是强致癌物

ex=386nm

em=430nm第23页,共61页，2024年2月25日，星期天2.刚性平面结构—较稳定的平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质第24页,共61页，2024年2月25日，星期天例1，2-二苯乙烯反式：平面构型强荧光体顺式：非平面构型非荧光体第25页,共61页，2024年2月25日，星期天（三）取代基的类型（1）增强荧光的取代基

-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给电子基团由于基团的n电子（孤对电子）的电子云与苯环上的轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强第26页,共61页，2024年2月25日，星期天（2）减弱荧光的取代基

-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱芳环上被F、Cl、Br、I取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为重原子效应。（3）影响不明显的取代基

-NH3+、-R、-SO3H等第27页,共61页，2024年2月25日，星期天三、环境对荧光、磷光的影响

1.溶剂的影响不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质溶剂的极性增强，荧光波长红移，强度增大

2.温度的影响——低温下测定，提高灵敏度因为辐射跃迁的速率基本不随温度变;非辐射跃迁随温度升高显著增大。荧光效率会随溶液温度升高下降，强度减弱。温度对磷光影响更大第28页,共61页，2024年2月25日，星期天3.pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长例：苯酚离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光第29页,共61页，2024年2月25日，星期天但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光例：

—苯酚有荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性第30页,共61页，2024年2月25日，星期天荧光池I0IIf荧光强度检测器四、荧光强度与荧光物质浓度的关系

强度为I0的入射光，照射到浓度很稀的荧光物质时,产生荧光，荧光强度If

与入射光强度有下面的关系：If=

fIa=

f（I0-I）Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度I为透射光

If=

f（I0-I010-A

）

=

fI0

（1-10-A

）I=I010-A第31页,共61页，2024年2月25日，星期天当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化

If=2.3

fI0A=2.3

fI0bc将上式展开第32页,共61页，2024年2月25日，星期天当A﹤0.05时，

If与

f、I0、

和c有关。对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，f、I0、

和b为常数，合并为K

If=KCIp=KC定量分析依据第33页,共61页，2024年2月25日，星期天荧光强度与物质浓度呈线形关系，

If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低。因为公式[]中后面影响；有时发生荧光猝灭效应第34页,共61页，2024年2月25日，星期天荧光猝灭

——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降(荧光效率

f下降)称为荧光猝灭。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂第35页,共61页，2024年2月25日，星期天氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂碰撞猝灭——M+激→M*M*+Q→M+Q+热自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象第36页,共61页，2024年2月25日，星期天（一）荧光分析仪器

——主要由光源、单色器、样品池、检测器和显示器组成。五、荧光和磷光分析仪器第37页,共61页，2024年2月25日，星期天光源第一单色器液池检测器第二单色器检测器放大器及记录器ex

em与分光光度计有两点不同①两个单色器②检测器与激发光互成直角I0I第38页,共61页，2024年2月25日，星期天1、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯应用最广泛的一种光源，可发射250~800nm很强的连续光源利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强第39页,共61页，2024年2月25日，星期天2、单色器荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长

ex

第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长

em。第40页,共61页，2024年2月25日，星期天3、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边4、检测器把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置扫描激发光谱和发射光谱记录,结果打印输出第41页,共61页，2024年2月25日，星期天（二）激发光谱和荧光、磷光光谱激发光谱：荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定I

ex固定

em荧光波长获得方法：固定

em不变，改变ex，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，ex为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱，确定最大ex第42页,共61页，2024年2月25日，星期天I

em固定

ex激发光波长获得方法：固定

ex不变，改变em，以I为纵坐标，em为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱从曲线上找出最大的em发射光谱：荧光、磷光光谱第43页,共61页，2024年2月25日，星期天

磷＞荧＞

激图吸收峰荧光峰磷光峰第44页,共61页，2024年2月25日，星期天激发光谱和荧光光谱荧光强度波长（nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱Iλλex,maxλfl,max第45页,共61页，2024年2月25日，星期天（三）磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。第46页,共61页，2024年2月25日，星期天六、

荧光、磷光分析及应用（一）定量分析方法定量分析依据If=KCIp=KC1.标准曲线法——最常用的定量分析方法浓度C1C2C3C4C5Cx荧光强度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC第47页,共61页，2024年2月25日，星期天2.荧光猝灭法把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性荧光物质M与猝灭剂Q生成不发荧光的基态配合物MQ

M+Q=MQ（非荧光物质）第48页,共61页，2024年2月25日，星期天猝灭剂加入前的荧光强度猝灭剂加入后试液的荧光强度常数猝灭剂浓度I前/I后与C(Q)有线性关系，可求猝灭剂含量经推导得出：第49页,共61页，2024年2月25日，星期天标准曲线法I前/I后xCQxCQI前/I后第50页,共61页，2024年2月25日，星期天3.比较法——比较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为Cs，Cs与未知液浓度Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液If

x=KCx

标准液If

s=KCs

比较第51页,共61页，2024年2月25日，星期天（二）荧光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1.无机化合物的分析与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等第52页,共61页，2024年2月25日，星期天2.有机化合物的分析芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等第53页,共61页，2024年2月25日，星期天例：3，4–苯并芘3，4–苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4–苯并芘，汽车尾气也是主要来源食品加工过程也会产生3，4–苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品分析测定：用环己烷将3，4–苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用95%C2H5OH稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量第54页,共61页，2024年2月25日，星期天例：VB2——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。在低浓度情况下，I=KC，I与C呈线性关系，在pH6