发酵过程控制

关于发酵过程控制第一节发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次一发酵过程的种类分批培养补料分批培养半连续培养连续培养第2页,共99页，2024年2月25日，星期天1、分批发酵简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。第3页,共99页，2024年2月25日，星期天分批培养中微生物的生长迟滞期对数生长期稳定期死亡期第4页,共99页，2024年2月25日，星期天1、比生长速率若细胞物质或细胞数目增长一倍的时间间隔是常数，则微生物是以指数速率增长，可用数学模型来描述。（1）

（2）

式（1）表明，细胞物质随时间的增加而增加式（2）表明，细胞数目随时间的增加而增加第5页,共99页，2024年2月25日，星期天

若μ为常数，则：

对式（1）积分得：

在大多数情况下，生长是以物质的增加衡量的，因而得到应用。

此式可在△t=td（td为倍增时间）时求得，td即在时所需时间，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

为比生长速率，单位是h-1。第6页,共99页，2024年2月25日，星期天

例题：某微生物的＝0.125h-1，求td。第7页,共99页，2024年2月25日，星期天微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期第8页,共99页，2024年2月25日，星期天随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。第9页,共99页，2024年2月25日，星期天分批培养的优缺点优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点产率低，不适于测定动力学数据第10页,共99页，2024年2月25日，星期天2、补料分批培养

在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。第11页,共99页，2024年2月25日，星期天补料分批培养的优缺点优点在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会第12页,共99页，2024年2月25日，星期天3、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵优点放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大第13页,共99页，2024年2月25日，星期天4、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。第14页,共99页，2024年2月25日，星期天连续培养的优缺点优点控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于μ＝D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。第15页,共99页，2024年2月25日，星期天二发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率第16页,共99页，2024年2月25日，星期天发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等第17页,共99页，2024年2月25日，星期天微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。第18页,共99页，2024年2月25日，星期天微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识第19页,共99页，2024年2月25日，星期天发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。第20页,共99页，2024年2月25日，星期天三发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。缺点如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性第21页,共99页，2024年2月25日，星期天数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。优点同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。第22页,共99页，2024年2月25日，星期天2、研究的层次初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。第23页,共99页，2024年2月25日，星期天代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的监控是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。第24页,共99页，2024年2月25日，星期天第25页,共99页，2024年2月25日，星期天鸟苷发酵过程曲线第26页,共99页，2024年2月25日，星期天生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。第27页,共99页，2024年2月25日，星期天第二节发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等第28页,共99页，2024年2月25日，星期天代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等第29页,共99页，2024年2月25日，星期天从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa(氧传递系数)等第30页,共99页，2024年2月25日，星期天直接参数又可分为在线检测参数和离线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。第31页,共99页，2024年2月25日，星期天一发酵过程主要分析的项目目前发酵过程主要分析项目如下1、pHpH与微生物的生命活动密切相关——酶催化活性

pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况第32页,共99页，2024年2月25日，星期天2、排气氧、排气CO2和呼吸熵排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。OUR=Qo2XQo2为呼吸强度，X为菌浓度排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。第33页,共99页，2024年2月25日，星期天RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量呼吸熵呼吸熵反映了氧的利用状况第34页,共99页，2024年2月25日，星期天

一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。第35页,共99页，2024年2月25日，星期天3、糖含量微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快。通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。

总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。

还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。第36页,共99页，2024年2月25日，星期天4、氨基氮和氨氮氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。第37页,共99页，2024年2月25日，星期天5、磷含量微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。第38页,共99页，2024年2月25日，星期天6、菌浓度和菌形态菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态显微镜观察菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓度的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。第39页,共99页，2024年2月25日，星期天第40页,共99页，2024年2月25日，星期天第41页,共99页，2024年2月25日，星期天菌浓测定方法测粘度压缩体积法（离心）静置沉降体积法光密度测定法OD600~660

适合于细菌、酵母第42页,共99页，2024年2月25日，星期天7、产物浓度

在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比生产速率，从而分析发酵条件如补料、pH对产物形成的影响。第43页,共99页，2024年2月25日，星期天二产物量的测定（一）产物量的特殊表示法1、抗生素效价的表示抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示效价表示方法：重量折算法重量单位类似重量单位特殊单位第44页,共99页，2024年2月25日，星期天重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位，如青霉素0.6微克＝1U重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u如链霉素、卡那霉素、红霉素等定义活性部分1μg＝1u第45页,共99页，2024年2月25日，星期天类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定义为1μg＝1u特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位制霉菌素1mg=3700u多粘菌素B1mg=10000u第46页,共99页，2024年2月25日，星期天2、酶活力的表示法酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成混乱，为此国际上作了统一规定，规定在250C下，以最适的底物浓度，最适的缓冲液离子强度，以及最适的pH诸条件下，每分钟能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性单位。第47页,共99页，2024年2月25日，星期天（二）产物量的测定1、化学法（1）滴定法产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定法如青霉素在碱性条件下加入过量的I2，反应生成青霉噻唑酸碘，用Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的单位柠檬酸可以用NaOH滴定来计算柠檬酸产量第48页,共99页，2024年2月25日，星期天（2）比色法产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓度成正比，可以用比色法测定。淀粉酶活力测定：在1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（3，5-二硝基水杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在540nm处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。第49页,共99页，2024年2月25日，星期天（3）测压法产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力变化，可以通过测定压力变化得知产物量。2、物理法许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或抗生素的含量。谷氨酸γ－氨基丁酸＋CO2第50页,共99页，2024年2月25日，星期天化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程分析缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生素成品的测定用生物法测定。

适用于抗生素效价的测定

生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准，其原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过16~18小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。3、生物法第51页,共99页，2024年2月25日，星期天常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为6mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量尽可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每碟15ml（下层），待其凝固。此外，将融化的培养基冷却到500C左右混入试验菌，将混有菌的培养基5ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。

第52页,共99页，2024年2月25日，星期天在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样品，加满后在370C培养16~18小时。在培养中,一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大，第53页,共99页，2024年2月25日，星期天r:抑菌圈的半径(毫米）M：抗生素在管中的量（单位）C：最低抑菌浓度（单位/毫升）H：培养基的厚度（毫米）L：管子的高度（毫米）D：抗生素的扩散系数（毫米/小时）T：细菌生长到肉眼所用的时间（小时）第54页,共99页，2024年2月25日，星期天抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T的影响但是C、H、D、T是无法测量的，在实际计算中要设法消去第55页,共99页，2024年2月25日，星期天一般的消去方法有二剂量法标准曲线法第56页,共99页，2024年2月25日，星期天两剂量法：标准品低单位总量:m抑菌圈半径SL标准品高单位总量:M抑菌圈半径：SH样品高单位总量:M’抑菌圈半径UH样品低单位总量:m’抑菌圈半径：UL已知：令：得出：→→第57页,共99页，2024年2月25日，星期天logM’—logM＝_logM’/M=同理logm’—logm=logm’/m==logθ=logθ2logθ=第58页,共99页，2024年2月25日，星期天logM’—logm’=logM’/m’==logKlogM—logm=logM/m==logK2logK=第59页,共99页，2024年2月25日，星期天标准曲线法优点：在一个碟子上可以同时做两个样品的效价，当要做的样品量大时，采取标准曲线法可以提高效率。假设选用的浓度为：3U，4U，5U，6U,7U中心点是5U1122第60页,共99页，2024年2月25日，星期天每个浓度做三个碟子。5U为中心点，每个碟子中有3个杯中加中心点浓度，其余3个加其它浓度。测得抑菌圈后，将浓度和抑菌圈平均直径做标准曲线。第61页,共99页，2024年2月25日，星期天logMr第62页,共99页，2024年2月25日，星期天管碟法影响因素的讨论：斜率小D、T大,误差小截距小C、D、T、H小，误差小第63页,共99页，2024年2月25日，星期天logMrlogM1r1r1r1第64页,共99页，2024年2月25日，星期天培养基厚度H越小，其它条件相同时r越大。影响H的因素：培养基的厚度细菌生长到肉眼所需的时间T越大在其它条件相同时，r越大影响T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件如：接种量，培养温度、及营养环境其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的温度、钢圈的放置、滴液第65页,共99页，2024年2月25日，星期天在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。一参数在线检测由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）传感器性能要稳定，受气泡影响小。第66页,共99页，2024年2月25日，星期天氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。CO2电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过电极膜，CO2和水反应，达到以下平衡：pH电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极CO2+H2OHCO3-+H+第67页,共99页，2024年2月25日，星期天什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累有机酸积累pH下降补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的[NH4+]积累，相应出现产苷速率下降。——代谢不正常第68页,共99页，2024年2月25日，星期天测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累第69页,共99页，2024年2月25日，星期天2、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和[NH4+]积累。第70页,共99页，2024年2月25日，星期天氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。第71页,共99页，2024年2月25日，星期天3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。第72页,共99页，2024年2月25日，星期天丙酮酸积累氨水补加增加[NH4+]积累抑制GS抑制TCA循环丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶EMP流量增加恶性循环丙氨酸积累第73页,共99页，2024年2月25日，星期天（二）代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析第74页,共99页，2024年2月25日，星期天12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。第75页,共99页，2024年2月25日，星期天丙酮酸激酶时序分析第76页,共99页，2024年2月25日，星期天丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素磷酸戊糖途径（HMP）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6－磷酸葡萄糖脱氢生成6－磷酸葡萄糖酸内酯。第77页,共99页，2024年2月25日，星期天6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6－磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。第78页,共99页，2024年2月25日，星期天三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。第79页,共99页，2024年2月25日，星期天柠檬酸合成酶时序分析第80页,共99页，2024年2月25日，星期天从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。第81页,共99页，2024年2月25日，星期天丙氨酸脱氢酶的时序分析第82页,共99页，2024年2月25日，星期天在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量第83页,共99页，2024年2月25日，星期天（三）与产物合成相关的酶和中间物测定例：螺旋霉素生物合成的代谢研究第84页,共99页，2024年2月25日，星期天图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径

第85页,共99页，2024年2月25日，星期天图1螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图

哪个代谢中间物过多积累第86页,共99页，2024年2月25日，星期天在发酵后期有FO-Ⅱ积累，要减少FO-Ⅰ转化为FO-Ⅱ必须降低C3酰化酶的活力，但这与SPⅡ、SPⅢ合成有矛盾在发酵结束时，SP-Ⅰ还有一定的积累，如能最大限度的转化为SP-Ⅱ、SP-Ⅲ，即加强步骤3对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-Ⅱ、NSP-Ⅱ的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4的通量。但由于这几个步骤的转化都是由C3酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。第87页,共99页，2024年2月25日，星期天图2有机酸前体的动态流量分布图第88页,共99页，2024年2月25日，星期天在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高值，对照图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径[9]，我们可以推测在发酵中前期在图3中的步骤1也即大环成环步骤有一定程度的“瓶颈”影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。我们测定了内酯环合成相关的酶活——前体的活化第89页,共99页，2024年2月25日，星期天