高速逆流色谱技术在天然产物分离

高速逆流色谱技术在天然产物分离Nature传统的天然产物化学研究工作ColumnChromatographyThinLayerChromatographyTraditionalResearchWorkofNaturalProductsChemistry第2页,共51页，2024年2月25日，星期天?传统的天然产物化学研究工作，百分之九十左右的时间在和一根柱子，一块板子打交道。如何实现分离手段的多样化？如何提高研究工作的效率？如何实现分离工作的仪器化，自动化，程序化？如何利用各种仪器的互补功能设计新的分离思路，创造新的分离手段？Whereisthewayout?第3页,共51页，2024年2月25日，星期天高速逆流色谱仪的出现，使得天然产物工作者看到了一丝曙光……AppearanceofHSCCC……Ourhope……第4页,共51页，2024年2月25日，星期天★HSCCC分离天然产物方法学研究★HSCCC分离香豆素类化学成分研究★HSCCC分离黄酮类化学成分研究★

HSCCC分离生物碱类化学成分研究★HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究★HSCCC联用分离技术研究主要内容：Contents:MethodologyresearchofHSCCCinseparationofnaturalproductsResearchofHSCCCinseparationofcoumarinsResearchofHSCCCinseparationofflavonoidsResearchofHSCCCinseparationofalkaloidsResearchofHSCCCinsystematicseparationofplantextractResearchofHSCCCcoupledwithotherinstruments第5页,共51页，2024年2月25日，星期天研究思路ResearchpatternHPLC分析方法的建立HSCCC溶剂系统的选择(分配系数的测定)HSCCC分离条件优化及HSCCC分离纯化化合物纯度测定化合物结构鉴定样品制备重要成分活性研究第6页,共51页，2024年2月25日，星期天HSCCC分离天然产物方法学研究MethodologyresearchofHSCCCinseparationofnaturalproducts第7页,共51页，2024年2月25日，星期天分离方法建立步骤：1.根据化合物极性、溶解性特点，结合同类型化合物研究文献，确定备选溶剂系统。2.建立目标化合物的TLC、HPLC分析条件。3.由所建立的HPLC分析条件准确测定各目标化合物在备选溶剂系统中的分配系数。4.由分配系数估算相应保留时间，分离度及峰宽等色谱参数。5.选择性的选取具有适宜色谱参数的溶剂系统进行预试。6.优化预试条件，确立最佳条件。Processofmethoddevelopment第8页,共51页，2024年2月25日，星期天水溶性和强极性正丁醇-醋酸-水正丁醇-甲醇-水(缓冲液)正丁醇-乙酸乙酯-水(缓冲液)乙酸乙酯-水(缓冲液)中等极性(氯仿溶解)氯仿-甲醇-水乙酸乙酯-甲醇-水正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水)弱极性(正己烷溶解)正己烷-乙腈正己烷-甲醇-水正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水)天然产物HSCCC溶剂系统选择（皂苷、强心苷、黄酮苷、多酚类等）（香豆素、醌类、苯丙素、生物碱、黄酮等）（萜类、甾体、脂肪酸等）Selectionofsolventsystems第9页,共51页，2024年2月25日，星期天

HPLC法测定分配系数的理论基础

（上相）TheoreticalbaseofK-valuedeterminationbyHPLC第10页,共51页，2024年2月25日，星期天分配系数(KD)与保留因子(κ)

关系研究Κ＝（VR－VM）/VM

Κ

＝KD（VS/VM）

＝KDφΦ——相比VR

＝VM＋KDVS

RelationshipofKDandK第11页,共51页，2024年2月25日，星期天分配系数(K)与分离度(Rs)

关系研究RelationshipofKandRs第12页,共51页，2024年2月25日，星期天0.821.272.023.004.485.13HSCCC峰宽度与分配系数K的关系分配系数保留时间(min)色谱峰宽(min)0.82118.210.41.27147.715.22.02196.223.23.00260.334.74.48355.952.95.13398.860.9RelationshipofKandpeakwidth第13页,共51页，2024年2月25日，星期天峰宽－分配系数关系图保留时间－峰宽－分配系数关系图第14页,共51页，2024年2月25日，星期天分离度与分配系数关系在螺旋管体积为300ml，相比为1，流速为2ml/min时，

tM=75min

K2/K1>1.2：Rs>1.0,两组分峰重叠小于2%K2/K1>1.31：Rs>1.5,两组分峰重叠小于1%

两组分分离程度的判断依据第15页,共51页，2024年2月25日，星期天HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究HSCCC分离香豆素类化学成分研究ResearchofHSCCCinseparationofcoumarins第16页,共51页，2024年2月25日，星期天白花前胡P.praeruptorumDunn.紫花前胡P.decursivum(Miq.)Maxim前胡Qian-hu1化学成分研究进展

以香豆素类化合物为主白花前胡:

以7,8-二氢吡喃骈香豆素类化合物为主紫花前胡:

以6,7-二氢吡喃骈香豆素类化合物为主2药理研究进展

心血管系统保护作用 抗血小板凝集作用 抗过敏作用 祛痰作用 抗癌作用

第17页,共51页，2024年2月25日，星期天白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLC色谱图色谱柱：SPHERIGELODSC18(250mm×4.6mmI.D.,5μm)

流动相：乙腈-水梯度洗脱模式：0-15min，乙腈比例由50%线性变为60%15-30min，由60%线性变为70%35min后，70%乙腈

色谱柱：SPHERIGELODSC18(250mm×4.6mm,5μm)

流动相：乙腈-水梯度洗脱模式：0-24min，50%乙腈24-40min，乙腈由50%线性变为65%第18页,共51页，2024年2月25日，星期天分离条件的摸索针对香豆素类化合物具有较低极性的特点，采用经济适用环保的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:4～7:6～3)系统，流速1～2ml/min，分离温度20～35

C

，根据等度洗脱各峰保留时间以及分离度决定是否采用梯度模式以及相应梯度条件。分离条件溶剂系统螺旋管的转速流动相的流速分离温度梯度模式SolventsystemFlowrateRevolutionspeedColumntemperatureGradientmodeSeparationcondition第19页,共51页，2024年2月25日，星期天溶剂系统（v/v）K(I)K(II)K(III)K(IV)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:5:5)1.101.744.4810.32石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5.5:4.5)0.831.272.817.65石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:6:4)0.430.642.184.99石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:6.5:3.5)0.240.311.282.33白花前胡各溶剂系统的K值测定第20页,共51页，2024年2月25日，星期天溶剂系统（v/v）K(I)K(II)K(III)K(IV)K(V)K(VI)乙酸乙酯-水(5:5)11.6----------乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)5.72----------乙酸乙酯-甲醇-水(5:2:5)3.03----------乙酸乙酯-甲醇-水(5:3:5)2.72----------石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:4:5)0.42----------石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:5:5)0.257.5212.5------石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:6:5)0.174.686.1211.3----石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:4)0.071.011.412.183.194.24石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:7:3)0.020.830.931.341.872.15紫花前胡各溶剂系统的K值测定第21页,共51页，2024年2月25日，星期天PW=11.726K推算由及白花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）以及（5:5:6.5:3.5）较为合适，采用梯度洗脱可使各目标化合物均具有较好分离度，适宜的峰宽和保留时间。而紫花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4）效果较为理想。第22页,共51页，2024年2月25日，星期天白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCC色谱图螺旋管转速：900r/min流动相流速：2.0mL/min分离温度：35

C流动相梯度模式：

0-150min:石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:5:5）的下相

150-300min:由5:5:5:5的下相线性变为5:5:6.5:3.5的下相

300min后:流动相为5:5:6.5:3.5的下相

螺旋管转速：900r/min流动相流速：2.0mL/min分离温度：20

C溶剂系统：石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:7:4，v/v），上相为固定相，下相为流动相第23页,共51页，2024年2月25日，星期天JournalofChromatographyA.2004,1057(1-2):89-94.2005,1076(1-2):127-32

第24页,共51页，2024年2月25日，星期天★Pd-D-V是首次以纯化合物形式分离得到，说明了HSCCC方法的分辨能力很高。★Ostruthin(欧芹素)首次从紫花前胡中分离得到。Ostruthin的含量并不低，但在以前的研究中未从紫花前胡中分离得到，这可能是由于该化合物在常规分离过程中易发生变化或易形成死吸附，这也说明了HSCCC方法的优越性。小结：conclusion第25页,共51页，2024年2月25日，星期天HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究HSCCC分离黄酮类化学成分研究ResearchofHSCCCinseparationofflavonoids第26页,共51页，2024年2月25日，星期天淫羊藿YingYangHuo

朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai.

系小檗科淫羊藿属植物(EpimediumkoreanumNakai.)的地上全草,主产于我国的辽宁、吉林等地1化学成分研究进展

8-异戊烯基取代的黄酮类化合物2药理研究进展心脑血管、免疫系统、骨代谢、生殖系统等具有广泛的药理作用,还有抗肿瘤作用第27页,共51页，2024年2月25日，星期天样品的制备60

C干燥粉碎至约30目1000g药材10L70%乙醇回流提取2次浸膏上D101大孔吸附树脂柱水洗至无色，5L70%乙醇洗脱减压旋转蒸发至干11.5g干粉回收溶剂Preparationofsample第28页,共51页，2024年2月25日，星期天色谱柱：YWGC18

柱(200mm×4.6mmI.D.,10μm)；流动相：乙腈-水0-12min:28%乙腈12-20min:乙腈由28%线性变为35%30min:35%乙腈流动相流速：1.0mL/minHPLC分析方法建立HPLCanalysis第29页,共51页，2024年2月25日，星期天乙酸乙酯-水：IcarisideII的纯度仅有68.2%乙酸乙酯-甲醇-水(5:1:5)：只有icariin的纯度较高，IcarisideII和epimedokoreanosideI的纯度较低，均不足80%当用乙酸乙酯-甲醇-水(5:2:5)

：所有的化合物的纯度均较差。氯仿-甲醇-水系统：分离条件的摸索根据黄酮极性特点，尝试采用乙酸乙酯-甲醇-水(5:0~3:5)，氯仿-甲醇-水(4:2.5~4:2)等体系：PW=11.726K推算由及适宜比例为4:3.5:2，此时各目标化合物均具有较好分离度，合适的峰宽和保留时间。Separationcondition第30页,共51页，2024年2月25日，星期天螺旋管转速：900r/min

流动相流速：2.0mL/min

分离温度：25

C

溶剂系统：

氯仿-甲醇-水4:3.5:2上相为固定相，下相为流动相98.7%99.1%98.2%HSCCC色谱图JournalofChromatographyA.2005,1064(1):53-7

第31页,共51页，2024年2月25日，星期天HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究HSCCC分离生物碱类化学成分研究ResearchofHSCCCinseparationofalkaloids第32页,共51页，2024年2月25日，星期天吴茱萸WuZhuYu

吴茱萸

Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth(E.rutaecarpa),为芸香科植物吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的近成熟果实，分布陕西、甘肃、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广东和广西等省区。秋季果实将近成熟尚未开裂时采收，除去果柄，晒干或烘干。1化学成分研究进展主含生物碱：吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸因碱、羟基吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱。2药理研究进展胃肠道作用，镇痛，中枢刺激，止血止泻等第33页,共51页，2024年2月25日，星期天色谱柱：SPHERIGELODSC18(250mm×4.6mmI.D.,5um)流动相：甲醇-乙腈-水0-22min:15:38:4722-65min:45:38:17流动相流速：1.0mL/min检测波长：254nmHPLC分析方法建立吴茱萸乙酸乙酯超声提取物（生物碱部位）HPLCanalysis第34页,共51页，2024年2月25日，星期天乙酸乙酯-水：生物碱基本分布于固定相中；乙酸乙酯-甲醇-水：当甲醇含量稍高时系统不易分层；环己烷－乙酸乙酯－甲醇－水：在引入环己烷后改善了系统分层状况。其中甲醇比例较小时，出峰延迟，峰型过宽；甲醇比例较大时固定相保留不理想。分离条件的摸索根据此类生物碱极性特点，尝试采用乙酸乙酯-水，乙酸乙酯-甲醇-水，环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水

(5:5:5~7:5)等体系：PW=11.726K推算由及确定适宜比例为5:5:7:5。Separationcondition第35页,共51页，2024年2月25日，星期天HSCCC色谱图螺旋管转速：900r/min

流动相流速：2.0mL/min

分离温度：25

C

溶剂系统：

环己烷-乙酸乙酯-甲醇-水5:5:7:5上相为固定相，下相为流动相JournalofChromatographyA,1074(2005)139–144第36页,共51页，2024年2月25日，星期天HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究ResearchofHSCCCinsystematicseparationofplantextract第37页,共51页，2024年2月25日，星期天

天然药物的总提取物往往含有从脂溶性到水溶性的具有广泛极性的一系列化学成分，若仅仅对其中主要成分进行HSCCC分离，不仅无法全面反映与活性相关的物质基础，而且以一种溶剂系统也难以一次性实现彻底的分离。若采用传统的系统溶剂分离法，将总提取物用不同的溶剂逐步划分为极性从小到大的不同部位，再针对不同部位，使用不同HSCCC溶剂系统进一步分离，不仅可以加快整体分离速度，而且有利于追踪主要活性部位，加大有效先导化合物的发现几率，从而使得整个分离工作的系统性、针对性和完整性得到了大大增强，最终将促进HSCCC技术成为天然产物化学研究中的常规分离手段，加快天然药物化学研究现代化步伐。第38页,共51页，2024年2月25日，星期天蓼科蓼属植物何首乌的块根，原植物广泛分布于四川、云南、河北、河南、山东、广东、广西、福建等省

1化学成分醌类化合物二苯乙烯苷类化合物2药理作用心血管系统、抗衰老、内分泌系统、消化系统、血液系统抗肿瘤作用抗病原微生物作用

何首乌HeShouWu第39页,共51页，2024年2月25日，星期天500g何首乌药材5L95%乙醇冷浸,回收乙醇浸膏(28g)300mL水分散,乙醚萃取乙醚部位(8.0g)水溶液正丁醇萃取正丁醇部位(7.5g)水部位(10g)D101大孔吸附树脂,30%乙醇洗脱精制正丁醇部位(3.5g)Separatedfractions：第40页,共51页，2024年2月25日，星期天ShimadzuVP-ODS柱(150×4.6mmI.D.,5

m)。甲醇-水梯度洗脱，0-60min内甲醇由5%线性变为100%；1.2mL/min；254nm。ShimadzuVP-ODS柱(150×4.6mmI.D.,5

m)。乙腈-水梯度洗脱，0-45min内乙腈由1%线性变为100%；0.8mL/min；254nm。

乙醚部位精制正丁醇部位HPLC成分分析HPLCanalysis第41页,共51页，2024年2月25日，星期天乙醚部位:主要为化合物I-IV采用分步洗脱的方法进行分离先用正己烷–乙酸乙酯–甲醇–水（3:7:5:5）体系使I和II分离开再用9:1:5:5体系的下相作流动相，将III洗脱出

IV则留在固定相中，回收固定相得到IV精制正丁醇部位:主要为化合物V-IX用乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50)体系进行分离先洗脱出V、VI、VII

改变HSCCC仪器螺旋管的旋转方向，同时将流动相变为乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50)上相，将VIII和IX洗脱出。

分离策略separationtactic第42页,共51页，2024年2月25日，星期天乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50):固定相：上相流动相：下相300min前正转乙酸乙酯–甲醇–水(50:1:50):固定相：下相流动相：上相300min后正转HSCCC分离：获得不同极性的一系列化合物200min前流动相为正己烷–乙酸乙酯–甲醇–水（3:7:5:5）下相，200min后为9:1:5:5下相，600min后停机吹出固定相

乙醚部位精制正丁醇部位(先)精制正丁醇部位(后)JournalofChromatographyA.2006,1115:64-71.第43页,共51页，2024年2月25日，星期天

HSCCC联用分离技术研究ResearchofHSCCCcoupledwithotherinstruments第44页,共51页，2024年2月25日，星期天分析仪器IR、MS、TLC、HPLC-DAD分离仪器HSCCCn

、PHPLC、SFE检测仪器UV-VIS、RID、ELSD第45页,共51页，2024年2月25日，星期天目前进行HSCCC联用研究时需要考虑以下问题：1．连接问题：目前仅借助通用分流阀来实现。没有专门的接口技术，也没有实现接口的模块化和自动化。2．流动相问题：

HSCCC适用的溶剂范围十分宽泛,但与之相连的仪器溶剂范围并不宽泛。3．分流问题：对于不同检测限的设备，为了达到不同的目的（分析或者制备），需采用不同