植物蛋白的提取方法

植物蛋白的提取方法一、单层贴壁细胞总蛋白的提取1.倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。2.每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS(0.01MpH=7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3.按1ml裂解液加10μlPMSF(100mM),摇匀置于冰上(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。4.每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中(整个操作尽量在冰上进行)。6.于4℃下12000rpm离心5min(提前开离心机预冷)。7.将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于-20℃保存。二、组织中总蛋白的提取1.将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2.加400μl单去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。4.裂解30min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按方法一操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:1.将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min。2.弃上清,加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。3.用枪吸干上清后,加100μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。四、LoadingBuffer煮细胞抽提总蛋白1.细胞计数(约1×106的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);2.预冷1×PBS500ul重悬洗一次,转至500ulEP管(2000rpm×5min);3.去上清,后甩一次,将上清去尽;4.按每1×106的细胞加50ul

loadingbuffer

加入2×loading;5.Vortex一下,煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝;6.每次煮好将其放于冰上,静置约2min,Vortex一下,再甩一下;7.三次后用枪吸起,如没有粘丝,即可;8.每次上样约5ul(50ug/ul蛋白)。五、RIPA裂解抽提总蛋白1.细胞计数(约1×107的细胞),离心收集细胞(2000rpm×5min);2.预冷1×PBS1ml重悬洗2次,转至1.5mlEP管(2000rpm×5min);3.去上清,后甩一次,将上清去尽;4.按照如下比例加入裂解试剂:RIPA:300ul/1×107细胞PMSF:3ul(1:100)Cocktail:0.3ul(1:1000)5.吹打均匀,冰上放置30-40min,中间每10分钟Vortex一次;6.4℃预冷离心:10000rpm×10min;7.收集上清,转移至已预冷新EP管,即为总蛋白。六、核、浆蛋白抽提收浆蛋白1.细胞计数(约1.5×107的细胞),离心收集细胞(1100rpm×5min);2.用4℃预冷的PBS重悬,转至1.5mL的EP管中,离心(4000rpm×5min,4℃);3.去上清,加入A

Buffer

1mL/1×107

cell,重悬,4℃放置10min,离心(2500rpm×3min,4℃);4.去上清,加入A’

Buffer

250uL/1.5×107

cell,重悬,4℃放置3min,离心(5000rpm×1min,4℃),吸取上清(上清是浆蛋白);收核蛋白5.再用A’

Buffer

500uL/1.5×107cell,重悬,4℃放置3min,离心(5000rpm×1min,4℃),吸走上清,12000rpm×30sec,把上清完全吸干净;6.剩余沉淀中加入B’

Buffer

(或者RAPI)50uL,重悬(振荡),4℃放置40min(每隔10min振荡一次);7.离心(12000×10min,4℃),取上清即为核蛋白,-80℃保存。BufferA的配制:剩余体积用ddH2O补足至要求体积!BufferA’的配制:BufferA’(2ml)

=1960ulBufferA+40uL10%NP-40

+20uL10mg/mLPMSF+1uLAprotininBufferA’(1ml)

=

980ulBufferA+20uL10%NP-40+10uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin(Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加)BufferB

的配制:剩余体积用ddH2O补足至要求体积!BufferB’的配制:BufferB’

=1mLBufferB+10uL10mg/mLPMSF+0.5uLAprotinin(可以用cockltail代替)七、核基质蛋白抽提Protocol1、细胞计数(约1×107的细胞),离心(1100rpm×5min)收集细胞;2、用4℃预冷的PBS重悬,将细胞移至1.5mlEP管中,1×PBS洗一遍;3、加300ul

RIPA/1×107的细胞,裂解细胞,至冰上15-30min;RIPA+PMSF(1:100)+Cocktail(1:1000)4、4℃预冷离心:13000rpm×10-15min;5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5mlEP管,冰上备用(总蛋白);6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍;7、加入Urea-Lysisbuffer

10-15ul裂解pellets,vortex10min;8、4℃预冷离心:13000rpm×10min;用BufferA90ul稀释,此为核基质蛋白。RIPA(PH8.0):150mMNaCL1%NP-400.5%DOC0.1%SDS50mMTrisUrea-Lysisbuffer(PH8.0):100mMNaH2PO410mMTris-HCL300mMNaCL8MureaBufferA:100mMNaH2PO410mMTris-HCL300mMNaCL1%TritonX-100八、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中,在冰上静置(3-4小时)。3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃。4、提取上清液,样品制备完成。蛋白质提取液:300ml1、1Mtris-HCl(PH8)45ml2、甘油(Glycerol)75ml3、Polyvinylpolypyrrordone6g这种方法针对SDS,垂直板电泳!或者用C2HCl3O2—C3H6O沉淀法,这种方法针对双向电泳,具有杂质少、离子浓度小的特点。当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!1、在液氮中研磨叶片。2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。3、加入等体积的冰浴C3H6O(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。药品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的C3H6O裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml九、组织中提取蛋白，肠黏膜为例应用TRIPURE

提取蛋白质步骤:1、含蛋白质上清液中加入C3H8O:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)倒转混匀,置室温10min离心:12000g,10min,4度,弃上清2、加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)振荡,置室温20min离心:7500g,5min,4度,弃上清重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次3、沉淀中加入100%乙醇2ml充分振荡混匀,置室温20min离心:7500g,5min,4度,弃上清,吹干沉淀4、1%SDS溶解沉淀离心:10000g,10min,4度5、取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)存在的问题:加入1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉淀,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右。解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2XBUFFER,然后煮5-10分钟,效果很好的。十、肿瘤组织0-4°C生理盐水冲洗组织表面血迹,以1:9(即100ug重量加入900ul体积)的比例加入蛋白匀浆提取液,0-4°C冰水混合物中用1ml匀浆器制成10%的蛋白匀浆。匀浆在10000xg离心10-15分钟,取上清备用。蛋白匀浆提取液(PH7.6):Nacl50mM

Tris10mM

EDTA1mM,

PMSF1mM,Na3VO4.12H2O0.5mM

NaF50mM

Benzamidine1mM十一、脑组织将切取的组织用4℃预冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍,再用滤纸吸干残留的PBS,将组织称重,将0.1g组织放入1ml的玻璃匀浆器,加入800l裂解液在冰上充分匀浆,将得到的匀浆液用液氮反复冻融3次,室温静置30mins,4℃15000r/min离心1h,小心避开脂层,吸取上清,分装,-80℃保存。裂解液配方如下:尿素7mol/lCH4N2S

2mol/lCHAPS4%(m/v)DTT65Mmol/L(上样前临加)IPGBuffer0.5%(V/V)(上样前临加)PMSF2ug/l(m/V)(上样前临加)DNA酶12ug/l(m/V)(上样前临加)RNA酶A2ug/l(m/V)(上样前临加)十二、酵母蛋白的提取方法1.准备SD/-Leu或是YPD培养基20ml,酵母过夜培养,30℃,230rpm。2.测OD600

约1.0。3.100ml过夜培养物,1000g,离心,5min,4℃。4.弃上清,重悬于80ul抽提buffer:0.1MTris-Cl(PH7.5),0.2MNaCl,0.01Mβ-ME,20%甘油,5mMEDTA,1mMPMSF。(100×):PMSF0.1742g溶于10mlC5H12O(主要抑制丝氨酸蛋白激酶),RT保存。5.转移上清到一预冷的玻璃管中,再加入玻璃珠33ul(425-600um)。冰上操作,涡流10min,但不包括样品的预冷时间。6.回收玻璃珠,并尽可能取上清到另一预冷的玻璃管中。7.40ul的抽提buffer,同上涡流。8.离心后分离上清(回收玻璃珠)。9.液氮快速冷冻,-70℃储存。十三、细菌总蛋白和膜蛋白提取方法（1）从新鲜样品中提取总蛋白（简易法）1、自配裂解液（pH8.5-9.0）：50mMTris-HCl，2mMEDTA,100mMNaCl，0.5%TritonX-100，调pH值至8.5-9.0备用；用前加入100μg/ml溶菌酶，1μl/ml的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml裂解液/1g湿菌体。2、将40ml菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1%SDS溶液透析后冻存。缺点：Westernblotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。（2）从Trizol裂解液中分离总蛋白1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1mlTrizol加入0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1mlTrizol加入1.5ml异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。4、用含有0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1mlTrizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。5、冷冻干燥5-10min，1%