第9章 DNA序列分析课件

第九章DNA序列分析第一节Maxam-Gilbert化学降解法第二节Sanger链终止法第三节DNA片段序列测定的策略第四节核苷酸序列的生物信息分析第9章DNA序列分析DNA测序（DNAsequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。确定DNA双股链上每一个独立结构单元或碱基的确切顺序。DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析，绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结构提供了工具。第9章DNA序列分析DNA测序的发展：1953年，Watson和Crick推导出DNA双螺旋结构；1954年，Whitfeld发明化学降解测序法；1972年，Berg开发DNA重组技术；1975年，Sanger发明加减测序法；1977年，Sanger发明双脱氧测序法；1986年，第一台半自动测序仪出现；2000年，Drosophila全基因组测序完成。第9章DNA序列分析DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。20实际80年代中期，测序仪出现。发展至今，自动化测序已成为当今DNA序列分析的主流。美国peabi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。第9章DNA序列分析最早的测序技术测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。第一代测序技术诞生1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后，在Sanger法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。另外，90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。除此之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法（pyrosequencing）、连接酶测序法（sequencingbyligation,SBL）、杂交测序法（sequencingbyhybridization,SBH）等。第9章DNA序列分析第二代自动测序技术尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，因此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序，而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。第9章DNA序列分析第三代基因组测序技术实现单分子速读据《自然》杂志网站2月8日报道，在美国佛罗里达州马可岛召开的“基因组生物学与技术进展大会”上，来自加利福尼亚门洛帕克市的太平洋生物科技公司(PacificBiosciences)介绍了其研制的第三代基因组测序仪，该测序仪实现了一次标记一个分子式的单分子速读。第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析序列测定的技术

杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法DNA芯片法经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法:第9章DNA序列分析第一节Maxam-Gilbert化学降解法

化学降解法：人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法。

第9章DNA序列分析碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。第9章DNA序列分析G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度~250bp。第9章DNA序列分析化学裂解法测定DNA的核苷酸序列第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第二节Sanger链终止法1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。Sanger法获得诺贝尔化学奖。一、Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。

第9章DNA序列分析与PCR反应类似。反应体系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；反应过程：变性－复性－延伸－终止Sanger双脱氧终止法第9章DNA序列分析Dideoxynucleotides

（双脱氧核苷酸）ddNTPs是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4：1)。第9章DNA序列分析*少一个－OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较H第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析二、双脱氧终止法测序反应体系：DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)第9章DNA序列分析Sanger法DNA测序的试剂①引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构②模板③

DNA聚合酶④

2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（2’,3’-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP）⑤

dNTP三、测序反应的种类①引物标记法(Dyeprimerreactions)②终止物标记法(Dyeterminatorreactions)第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.第9章DNA序列分析Thisfigureisarepresentationofanacrylamidesequencinggel.NoticethatthesequenceofthestrandofDNAcomplementarytothesequencedstrandis5'to3'ACGCCCGAGTAGCCCAGATTwhilethesequenceofthesequencedstrand,5'to3',isAATCTGGGCTACTCGGGCGT第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引物终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳：ACGT次序，高压电泳4.放射自显影得到直读图象第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析Sanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快第9章DNA序列分析ddNTPs参与下的DNA复制Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；

第9章DNA序列分析GelElectrophoresis

DNAFragmentSizeDeterminationDNA带负电DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关Sanger第二步：荧光检测第9章DNA序列分析除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。第9章DNA序列分析DNA片断序列测定的策略测定未知序列的DNA片断一次测序结果有长度限制（﹤1000bp)

通用引物指导未知序列的测定引物步移随机克隆测序缺失克隆测序第9章DNA序列分析通用引物指导未知序列的测定根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断第9章DNA序列分析引物步移策略将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。定向缺失克隆策略、染色体步查法等。第9章DNA序列分析鸟枪测序法(shotgunsequencing)：随机克隆测序

将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一定程度后，相当于待测DNA片断的每一部位的序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序。

第9章DNA序列分析将DNA大片段切割成小片段的三种方法：限制性内切酶酶切超声波处理

DNA酶I降解(加Mn2+)第9章DNA序列分析鸟枪法测序的缺点随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。第9章DNA序列分析完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：（1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（YeastArtificialChromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（BacterialArtificialChromosome）克隆等；（2）利用鸟枪法（ShotgunStrategy）测定每个克隆的序列；（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。

基因组测序第9章DNA序列分析DNA全序列切成小段小段和载体结合结合后进行测序第9章DNA序列分析MapfragmentsSequenceoverlapping

fragmentsAssembled

sequence基因组DNA序列测定示意图通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过“拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。Sequenceallfragmentsandassemble第9章DNA序列分析四、大规模DNA测序的趋势－自动化DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。目前，DNA制备、克隆文库组建及筛选、DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克隆群顺序排定等过程均已平行发展，自动化操作紧随其后。随着DNA测序不断由半自动化向自动化过渡，原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的散测序组装起来，以实现DNA测序的完整性。目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。第9章DNA序列分析1、克隆筛选从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。2、模板制备现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板。特定用途的DNA分离仪也已采用。3、测序反应由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以，DNA测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。4、自动放射性自显影阅读机近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。5、自动测序仪DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。第9章DNA序列分析310型全自动遗传分析仪DNA全自动分析仪：ABIPrism®3100遗传分析仪

3700型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE500/1000/4000

第9章DNA序列分析分析仪器的新发展：377型遗传分析仪3730型遗传分析仪

377型DNA全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合美国应用生物系统(ABI)公司专利的四色荧光标记，激光检测，一个泳道检测的方法，一个测序反应保证500bp的准确序列。

3730型DNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效果更好，通量更大，一个测序反应保证800bp的准确序列，是当前基因测序的主打。第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析第9章DNA序列分析优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；

ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；