高效液相色谱法新

高效液相色谱法新第10章高效液相色谱法13.1HPLC概述13.2HPLC分类与基本原理13.3各类高效液相色谱法13.4固定相13.5流动相13.6高效液相色谱仪13.7定性、定量分析方法13.8应用与示例第2页,共47页，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述1.基本概念与特点2.HPLC与经典LC的比较3.HPLC仪器结构第3页,共47页，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述概念：高效液相色谱法是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液泵和高灵敏度在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。特点：适范围广、分离性能好、分析速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、操作自动化等。1.基本概念与特点2.HPLC与经典LC的比较3.HPLC仪器结构第4页,共47页，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述HPLC与经典LC的比较一览表经典液相色谱高效液相色谱常压或减压高压，40～50MPa填料颗粒大填料颗粒小，2～50μm柱效低柱效高,40000～60000块/m分析速度慢分析速度快色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测1.基本概念与特点2.HPLC与经典LC的比较3.HPLC仪器结构第5页,共47页，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述HPLC仪器结构示意图1.基本概念与特点2.HPLC与经典LC的比较3.HPLC仪器结构第6页,共47页，2024年2月25日，星期天13.2HPLC分类与基本原理化合物的极性、电荷、分子大小、旋光性四种主要性质，化合物这些性质的差异是引起高效液相色谱分离本质性原因，对应着分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱、手性色谱等分离方法。1.方法分类2.基本原理第7页,共47页，2024年2月25日，星期天13.2方法分类与基本原理HPLC与GC在基本原理、概念和方法基本上相同，主要差别是流动相的性质不同。因此，某些公式的表现形式或参数的含意有些差别。(1)HPLC中的vanDeemter方程表现形式：H=A+Cu1.方法分类2.基本原理第8页,共47页，2024年2月25日，星期天13.2HPLC分类与基本原理3145uHPLCGCH2图10-2流动相的流速对GC与HPLC柱效影响对比(2)HPLC中涡流扩散和传质阻力对柱效的影响1.方法分类2.基本原理第9页,共47页，2024年2月25日，星期天13.2HPLC分类与基本原理(3)HPLC分离条件选择①采用小颗粒、窄粒度分布的球形固定相、首选化学键合相，匀浆法装柱；②采用低黏度流动相、低流速(1mL/min)；③柱温保持在25-30℃为宜。1.方法分类2.基本原理第10页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法13.3.1液-固吸附色谱法13.3.2液-液分配色谱法13.3.3化学键合色谱法13.3.4其他色谱法第11页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法>>

13.3.1液-固吸附色谱法分离机理吸附色谱法是被分离的组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，靠组分分子的吸附系数的差异而分离。在吸附色谱中，选择使用条件使组分间的分配系数K产生差别，以达到分离的目的。由于表面积S不易测，而k=KS/Vm，因此常用k代替K来填料问题。第12页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法>>

13.3.1液-固吸附色谱法影响容量因子的因素以硅胶吸附剂为例(1)硅胶的活性硅胶必须保持干燥，遇水会失活，烘干可再生。使用硅胶柱进行色谱分离时，必须使用不含水的流动相。硅胶活性越大，k越大，tR越长。(2)溶剂的极性与硅胶吸附剂配套的流动相，是以烷烃为底剂加适当极性调整剂，组成二元或多元溶剂系统。溶剂的极性越大，k越小，tR越短。(3)容量因子序组分的极性越大，在硅胶吸附剂表面的保留作用(亲和力)就越强，k越大，tR越长。第13页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法>>

13.3.2液-液分配色谱法分离机理：分配色谱法是由于样品组分溶入固定相与流动相达到“平衡”后分配系数的差别而分离。不同组分在固定相与流动相中的溶解度差别越大(K、k差别也大)分离效果越好。正相液-液色谱法：极性：流动相＜固定相。极性小的组分先出峰、极性大的组分后出峰。反相液-液色谱法：极性：流动相＞固定相。极性大的组分先出峰、极性小的组分后出峰。第14页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法将固定液的官能团键合在载体的表面就构成了化学键合相，以此为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法(bondedphasechromatography，BPC)。化学键合相既有分配作用，又有吸附作用，应用广泛硅胶内部十八烷基硅烷键合相ODS硅胶表面硅胶内部第15页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法正相键合相色谱法反相键合相色谱法离子对色谱法离子抑制色谱法第16页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法正相键合相色谱法固定相：极性大的化学键合相，如氰基、氨基化学键合相；流动相：极性小的烷烃(正己烷)加适量极性调整剂构成。分离机理主要靠范德华力(定向、诱导)或氢键作用力的差别而分离。流动相的极性与容量因子的关系流动相极性增大，洗脱能力增加，k减小、tR减小。第17页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法反相键合相色谱法RBPC典型的RBPC：非极性键合固定相＋极性流动相组成。固定相：ODS；流动相：甲醇-水，乙腈-水。非典型RBPC：弱极性或中等极性键合相＋极性大于固定相的流动相组成。分离机理疏溶剂理论、双保留理论、顶替吸附-液相相互作用模型等。流动相的极性与容量因子的关系流动相的极性增大，对组分的洗脱能力降低，k增大、tR增大；反之，k减小、tR减小。第18页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法离子对色谱法有正相、反相之分，常用反相的。反相离子对色谱法：由于离子型化合物在非极性固定相中的溶解度很小，几乎没有保留作用。为此，加入与其带相反电荷的离子对试剂，生成不荷电的中性离子对，而中性离子对在非极性固定相中的溶解度大大增加，分配系数增大，分离效果明显得到改善。这种方法被称为反相离子对色谱法。实现方法：用ODS柱，在流动相甲醇-水或乙腈-水中加入0.003~0.01mol/L的RPIC试剂即可。离子对试剂PIC价格较贵分离碱类-烷基磺酸盐；分离酸-四丁基季铵盐。第19页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法离子对色谱法分离机理以分离碱类为例分配系数其K除与RHPLC有相同的影响规律外，还与PIC试剂的碳链长度有关，链增长K增大。第20页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法

13.3.3化学键合相色谱法离子抑制色谱法弱酸、弱碱组分容易解离，在非极性固定相中的溶解性很差，可通过调节流动相pH来抑制它们的解离，使之以分子的形式存在，从而增加它在固定相中的溶解度，增加保留作用，以达到分离目的。适用范围pKa：3~7的弱酸，7~8的弱碱抑制剂乙酸、甲酸、氨水、磷酸盐、乙酸盐等。容量因子及其影响因素除与RHPLC有相同影响因素外，主要受流动相pH的影响。对于弱酸，流动相的pH＜pKa时，抑制解离，k增大、tR增大；流动相的pH＞pKa时，利于解离，k减小、tR减小。对于弱碱，情况相反。第21页,共47页，2024年2月25日，星期天13.3各类高效液相色谱法>>

13.3.5其他色谱法(阅读)离子色谱法手性色谱法环糊精色谱法胶束色谱法亲和色谱第22页,共47页，2024年2月25日，星期天13.4固定相13.4.1液-固色谱固定相13.4.2化学键合相13.4.3其他固定相第23页,共47页，2024年2月25日，星期天13.4固定相

13.4.1液-固色谱固定相硅胶：无定形全多孔硅胶、球形全多孔硅胶、堆积硅珠、灌注微粒硅胶、硅-碳杂化硅胶、硅聚合物薄膜型硅胶。高分子多孔微球：有机胶，由苯乙烯与二乙烯苯交联而成。分离机理主要为吸附作用，兼有分配及空间排阻作用，其表面为芳烃官能团(非极性)，流动相为极性溶剂，相当于反相洗脱。第24页,共47页，2024年2月25日，星期天13.4固定相>>

13.4.2化学键合相用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点：使用过程不流失；化学性能稳定(pH=2~8)；热稳定性好(＜70℃)；载样量大；适于梯度洗脱。用于键合相的载体一般为硅胶，它具有分配作用及一定的吸附作用。吸附作用的大小视键合覆盖率而定，完全覆盖则称为封尾，封尾键合相只有分配作用没有吸附作用，强疏水性是其缺点。依据键合相官能团极性的大小，分为三类：非极性键合相、中等极性键合相和极性键合相。第25页,共47页，2024年2月25日，星期天13.4固定相>>

13.4.3其他固定相离子交换剂凝胶手性固定相亲和色谱固定相第26页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相13.5.1分离方程式13.5.2Snyder溶剂分类13.5.3正相洗脱与反相洗脱13.5.4洗脱方式13.5.5溶剂系统选择第27页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.1分离方程式在GC中，α与k主要分别受固定相性质与柱温的影响。在HPLC中，α主要受溶剂种类的影响；在溶剂的组成确定以后，k主要由溶剂的配比所左右。选择溶剂系统是以获得较大α与适宜k值，而使k与tR合乎要求为目的。HPLC对流动相的基本要求：不与固定相发生化学反应；对样品有适宜的溶解度，要求k在1~10范围(2~8最佳)；黏度小；与检测器相适应。第28页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.2Snyder溶剂分类组分的分配系数，由样品组分、溶剂、固定相三者的分子间作用力综合作用所决定。Snyder选用了3个参考物以检验3种分子间作用力，测定、计算出溶剂的极性参数值，值大的溶剂极性大，洗脱能力大。表10-2参考物与被检溶剂的作用力关系参考物被检溶剂的作用力类型乙醇(质子给予体)质子受体作用力(Xe)二氧六环(质子受体)质子给予作用力(Xd)硝基甲烷(强偶极)强偶极作用力(Xn)第29页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.2Snyder溶剂分类表13-3常用溶剂的极性参数P’与分子间作用力溶剂P’XeXdXn苯2.70.230.320.45乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53正丙烷4.00.530.210.26四氢呋喃4.00.380.200.42氯仿4.10.250.410.33乙醇4.30.520.190.29乙酸乙酯4.40.340.230.43丙酮5.10.350.230.42甲醇5.10.480.220.31乙腈5.80.310.270.42乙酸6.00.390.310.30水10.20.370.370.25第30页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.3正相洗脱与反相洗脱正相洗脱：流动相的极性小于固定相的洗脱方式。正相洗脱溶剂一般为多元溶剂系统，洗脱能力以极性参数P’来表示。反相洗脱：在反相洗脱中，溶剂的洗脱能力用强度因子S来衡量。S值越大洗脱能力越强。水在正相色谱中洗脱能力最强，但在反相色谱中洗脱能力最弱，所以一般以水为底剂，再加甲醇、乙腈、四氢呋喃的某一种组成二元溶剂系统。表13-5反相洗脱溶剂的强度因子S值溶剂水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇异丙醇四氢呋喃S值03.03.23.43.53.64.24.5组别ⅧⅡⅥⅥⅥⅡⅡⅢ第31页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.4洗脱方式等度洗脱：恒定配比的溶剂系统的洗脱方式，是常用洗脱方式，方法简便、重复性好、色谱柱易再生，对复杂样品分离不理想。梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相浓度配比的洗脱方式，适合于对复杂样品中性质差异很大的组分的分离。优点：缩短分析周期、提高分离效果、改善峰形减小拖尾、增加检测灵敏度等。第32页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.4洗脱方式Fig.4.

Chromatogramsofseparationofetherfunc-tionalizedimidazoliumionicliquids.(醚功能化的咪唑类离子液体的色谱分离)A.Isocraticelution(等度洗脱),mobilephase10%CH3CN/10

mMNaH2PO4/H3PO4,pH5.0.B.Gradientelution(梯度洗脱).Theconcentrationratioofacetonitriletobuffersolutionatthegradientchanged(乙腈梯度缓冲液的浓度比变化):0

min,0%,CH3CN；3–6

min,2%CH3CN；12–20

min,5%CH3CN；20–40

min,10%CH3CN。Column:AlltechMixed-ModeRP-C18/Cation100Acolumn(250

mm

×

4.6

mmI.D.,5

μm).Sampleconcentrationinmobilephase:0.5

mg·mL−1.1–[C2OHmim][Cl],2–[C6O2OHmim][Cl],3–[C3Omim][Cl],4–[C5O2mim][Cl],5–[C4Omim][Cl],6–[C2OAllymim][Cl],7–[C7O3mim][Cl],8–[C2OBzmim][Cl].第33页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.4洗脱方式比较GC的程序升温和HPLC的梯度洗脱程序升温：通过改变温度来影响溶质的K值，用于分离宽沸程的混合样品。梯度洗脱：通过改变流动相的强度因子、pH值等来影响溶质的K值，用于分离组分性质(极性)差别较大的复杂样品。第34页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.4洗脱方式问题：如何区分“正相洗脱/反相洗脱”与“等度洗脱/梯度洗脱”两组概念？以流动相与固定相的相对极性大小来分类：流动相极性小于固定相极性的洗脱方式，称为正相洗脱；流动相极性大于固定相极性的洗脱方式，称为反相洗脱。以流动相本身的配比是否有变化来分类：流动相的溶剂配比恒定的洗脱方式，称为等度洗脱；流动相的溶剂配比，在一个周期内按一定程序不断改变的洗脱方式，称为梯度洗脱。第35页,共47页，2024年2月25日，星期天13.5流动相>>

13.5.4溶剂系统选择溶剂选择的一般原则首选溶剂多元溶剂选择的组成溶剂系统对样品的洗脱能力替代溶剂系统离子抑制色谱法第36页,共47页，2024年2月25日，星期天13.6高效液相色谱仪13.6.1输液泵13.6.2进样器与色谱柱13.6.3检测器13.6.4超高效液相色谱仪HPLC仪组成部件：输液泵、进样器、色谱柱、检测器及工作站等。第37页,共47页，2024年2月25日，星期天13.6高效液相色谱仪>>

13.6.1输液泵输液泵是实施流动相输送任务的部件。按输出液体情况，分为恒压泵和恒流泵(螺旋泵/往复泵)。柱塞往复泵：图示梯度洗脱装置：按多元流动相加压与混合顺序，分为高压梯度(加压-混合-输出)与低压梯度(混合-加压-输出