多肽合成与生物活性肽省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

多肽合成与生物活性肽1/68一、多肽与多肽合成2/68氨基酸甘氨酸（Gly、G）、丙氨酸（Ala、A）、苯丙氨酸（Phe、F）、谷氨酰胺（Gln、Q）、天冬酰胺（Asn、N）、缬氨酸（Val、V）、亮氨酸（Leu、L）、异亮氨酸（Ile、I）、脯氨酸（Pro、P）、甲硫氨酸（Met、M）、半胱氨酸（Cys、C，巯基）、丝氨酸（Ser、S，羟基）、苏氨酸（Thr、T，羟基）酪氨酸（Tyr、Y，酚羟基）、色氨酸（Trp、W，吲哚基）、谷氨酸（Glu、E，羧基）、天冬氨酸（Asp、D、羧基）、赖氨酸（Lys、K，氨基）、精氨酸（Arg、R，氨基）、组氨酸（His、H，胺基）3/68多肽（蛋白质）

氨基酸“首－尾”以酰胺键相连，相连氨基酸数较少时称多肽，较多时称蛋白质。多肽、蛋白质4/68人工合成胰岛素

1965年，我国上海生化所、上海有机所和北京大学科学家经过6年多努力，在世界上首次人工合成含有生命活力蛋白质－牛胰岛素。（1953年合成八肽－催产素，取得了1955年诺贝尔化学奖。）

胰岛素由A、B两个肽链组成，A链有21个氨基酸，B链有个30个氨基酸，A链和B链间由三个二硫键连接起来。5/68

上面氨基酸缩合脱水形成肽反应式在生物体内多肽、蛋白质合成是成立，但在人工合成多肽时，这一反应式是不能实现。6/68液相法合成多肽

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固相多肽合成方法

Merrifield在1962年开创了固相多肽合成法，并于1984年取得诺贝尔化学奖。固相多肽合成法原理：用交联聚合物树脂作为载体，肽合成在交联聚合物树脂内进行（共价固载于载体上）。交联聚合物树脂在任何溶剂中都不能溶解，但在一些溶剂中可溶胀，这么反应物、催化剂等可扩散到树脂内部参加反应。每一步反应结束后，经过简单过滤、洗涤，即可将剩下反应物、催化剂、副产物等去掉，然后进行下一步反应。最终将合成肽从树脂上裂解下来。8/68聚合9/68功效基基化10/6811/68固相合成12/68固相合成优点能够用过量反应试剂使反应完全。每步产物都固定于不溶于任何溶剂固相载体上，所以所需产物与其它过量试剂、催化剂等小分子试剂分离可经过简单过滤而实现。在裂解前全部操作步骤中，固相载体一直处于同一容器中，没有任何机械损失。能够用大过量反应试剂及催化剂，使每一步反应趋于完全，提升产率，使最终产物纯化愈加轻易。没有液相法中碰到当肽链较长时不易找到适当溶剂问题。轻易实现自动化。现已经有自动化程度很高自动多肽合成仪。13/68二、生物活性肽14/68

生物活性肽在生命活动中起着非常主要作用，如胰岛素、生长激素、促肾上腺皮质激素、催产素等。许多天然活性肽或天然活性肽类似物也是非常主要药品，多肽作为药品含有以下优点。高效、专一，用量少

如鲑鱼降钙素剂量为20g/支（50000支/g)结构多变，伴随各种生物技术和计算机模拟技术发展，可得到含有各种功效多肽药品

如在计算机模拟基础上，设计合成了治疗艾滋病多肽药品T-20。FDA已同意200各种多肽和蛋白质药品临床应用。代谢产物为无毒氨基酸15/68抗菌素耐药性

抗菌素使用挽救了无数生命，使人预期寿命增加了十年以上。但伴随抗菌素使用，细菌也逐步对其产生了耐药性。一个新药研制平均周期是约10年，而一个新抗菌素临床使用后细菌对其产生耐药性平均时间为约2年。

一些超级细菌对当前使用全部抗菌素包含被称为抗菌最终防线万古霉素含有耐药性。细菌感染住院患者中约7%因为耐药细菌感染而死亡。

阳离子抗菌肽16/68抗菌素种类

-内酰胺类大环内酯类喹诺酮四环素类氨基糖苷类磺胺类17/68耐药机理1.细菌变异细胞壁上抗菌素结合部位，使抗菌素失去与细胞壁结合能力。

如万古霉素与细菌细胞壁粘肽末端-D-Ala-D-Ala结合，从而抑制细菌一些生理功效，起到抑菌作用。

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抗万古霉素细菌则把-D-Ala-D-Ala变异成-D-Ala-D-Lac，使万古霉素对其失去结协力而不起作用19/682.经过分泌

-内酰胺酶而破坏化学上很不稳定

-内酰胺类抗菌素

-内酰胺环。3.分泌某种酶修饰抗菌素上一些基团如乙酰化羟基等。20/68阳离子抗菌肽1981年Boman等人从西哥罗佩蛾（MothHyalophoracecropia）体中分离得到抗菌多肽天蚕素（cecropin）（Nature，1981，292，246）。抗菌肽广泛存在于动植物体内，用来对付细菌、病毒和真菌等，已发觉抗菌肽已超出1000种。抗菌肽中都含有较多碱性氨基酸，在生理条件下带净正电荷，所以也叫阳离子抗菌肽。21/68

抗菌肽阳离子部分与细菌细胞膜（阴离子性磷脂膜）磷酸基负离子结合（静电作用），多肽疏水部分与细胞膜碳氢链结合（疏水作用），从而起到抑菌作用。

抗菌机理22/68抗菌肽不易产生耐药性原因

因为阳离子多肽与细菌细胞膜结合特异性不高，细菌不易经过简单变异或修饰多肽产生耐药性。

抗菌肽副作用

大部分抗菌肽除含有抗菌活性外，对哺乳动物细胞也有毒性，如溶血活性。

抗菌肽抗菌活性和溶血活性都由多肽两亲性引发，但一些抗菌肽含有溶血活性，而另一些抗菌肽没有溶血活性现象不能到达满意解释。23/6824/6825/68*BC,bloodcell;H,haemolymph;E,epithelialtissue.M.Zasloff,Nature,,415,389-39526/68TableCommercialdevelopmentofantimicrobialpeptidesofanimaloriginModeofusePeptideCompanyApplicationStageToticalMSI-78GenaeralInfecteddiabeticCompletedPhaseIII;notfootulcersapprovedbyFDA,pend-ingadditionalstudiesToticalMBI-226MicrologixCatheterinfectionPhaseIIIToticalMBI-594MicrologixAcnePhaseIIOralIB-367IntrobioticsMucostisPhaseIIIOralP-113DemegenGingivitisPhaseIISystemicHeliomycinEntomedAntifungalPreclinicalSystemicHumanAMPharmAntibacterialPreclinicallavotoferricinSystemicBPIXomaMeningococcalPhaseIIImeningitisM.Zasloff,Nature,,415,389-39527/68当前研究热点抗菌机理、溶血机理提升抗菌活性，抗菌活性不够高，因而用量较大减小链长，肽链较长时合成成本高，且免疫源性高较少溶血副作用

28/68GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2Melittin氨基酸序列蜂毒肽(melittin)类似物

我们研究发觉，蜂毒肽12－26残基片断基本保留抗菌活性，但溶血活性基本消失。

蜂毒肽由26个氨基酸组成，含有很强抗菌活性，同时还含有很强溶血副作用。29/68Melittin短缺肽及其类似物抗菌和溶血活性

PeptideHD50ag.HRBC（

g/ml）MICag.SA（

g/ml）Melittin56.25M(13-26)

1000012.5M(12-26)

1000012.5M(11-26)

100006.25M(11-26,G12W192L)11006.25M(11-26,G12A15W193L)2903.130/68以M(12-26)为模板，逐一改变1-9位疏水性

GLPALISWIKRKRQQ-NH2结果：右侧氨基酸疏水性增加，则其抗菌活性显著增加；左侧氨基酸疏水性增加，则其抗菌活性略有增加。右侧氨基酸疏水性增加，则其溶血活性减小；左侧氨基酸疏水性增加，则其溶血活性增加。31/68三、聚合物修饰多肽、蛋白质药品32/68多肽、蛋白质药品缺点口服生物利用率低

消化系统各种蛋白水解酶降解作用保留寿命短血液半衰期短

血液及各器官中蛋白水解酶降解作用、肾过滤清楚作用含有免疫原性不易穿透生物膜33/68聚乙二醇，poly(ethyleneglycol)(PEG)，poly(ethyleneoxide)(PEO)：特征：两亲性，既亲水又亲油，可溶于水和许多有机溶剂如卤代烃，链高度柔顺。无毒，可静脉注射、口服和外用高生物相容性，是已知聚合物中对蛋白质吸附作用最小聚合物。表面用PEG修饰可减小对蛋白质吸附，进而降低被RES俘获和免疫反应。34/68多肽、蛋白质药品用PEG修饰MainadvantagesofPEGylatedprotein.35/68PEGconjugateTypeofPEGylationsYeartomarketDiseasePEG–asparaginase(Oncaspar®)Random,linearPEG1994AcutelymphoblasticleukemiaPEG–adenosinedeaminase(Adagen®)Random,linearPEG1990Severecombinedimmunodeficiencydisease(SCID)PEG–interferonα2a(Pegasys®)Random,branchedPEG40kDaHepatitisCPEG–interferonα2b(PEG–Intron®)Random,linearPEG12kDaHepatitisCandclinicaltrialsforcancer,multiplesclerosis,HIV/AIDSApprovedPEGconjugates36/68PEGconjugateTypeofPEGylationsYeartomarketDiseasePEG–G-CSF(pegfilgrastim,Neulasta®)Selective,linearPEG20kDaTreatingofneutropeniaduringchemotherapyPEG–growthhormonereceptorantagonist(Pegvisomant,Somavert®)Random,linearPEG5kDa(geneticmodifiedprotein)AcromegalyApprovedPEGconjugates(continued)37/68PEG修饰多肽、蛋白质药品作用柔顺PEG链及其结合水分子对多肽、蛋白质起到保护作用，减小蛋白酶对其降解作用。PEG修饰使其分子量增大，减小肾过滤去除作用。PEG保护作用减小其免疫原性。PEG化后在更宽pH和温度范围内更稳定。使多肽、蛋白质药品含有更高疗效显著延长其血液半衰期副作用小保留时间长38/68PEG分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药品影响PEG分子量愈大，则对多肽、蛋白质保护作用愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。支化PEG对多肽、蛋白质保护作用比直链PEG大。PEG化往往使多肽、蛋白质体外生物活性降低。PEG分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。

PEG分子量大小对多肽、蛋白质保护作用影响和对其体外生物活性影响是相互矛盾。39/68Interferon

-2aPEG化ReactionmechanismofthesynthesisofPEG2-IFN.P.Bailon,etal.,BioconjugateChem.,,12,195-202

40/68InVitroAntiviralActivitiesofInterferon

-2aandPEG2-IFNInterferon

-2aPEG化后其血清半衰期增加了70倍。41/68Invivoantitumoractivityofinterferon

-2a(toppanel)andPEG2-IFN(bottompanel)42/68Growthhormone-releasingfactor(GRF)PEG化假如多肽中含有多个氨基，PEG化往往得到混合物。P.Espositoa,etal.,Adv.DrugDeliveryRev.,55,1279–1291PrimaryaminoacidsequenceofGRF43/68InvitrobiologicalactivityofthetwoisomerscompositionGRF–1PEG5000andofthetwosinglemono-PEGylatedisomers44/68Biologicalstabilityinhumanpooledplasma45/6846/68抗菌肽PEG化Nisin用5000kDaPEG修饰后抗菌活性完全丧失。A.Guiotto,etal.,IlFarmaco,58,45-5047/68tachyplesin用5000kDaPEG修饰Y.Imura,etal.,Biochim.Biophys.Acta,1768,1160–116948/68PEG分子量、支化对修饰多肽、蛋白质药品影响PEG分子量愈大，则对多肽、蛋白质保护作用愈大，血液半衰期愈长，免疫原性愈小。支化PEG对多肽、蛋白质保护作用比直链PEG大。PEG化往往使多肽、蛋白质体外生物活性降低。PEG分子量愈大，体外生物活性降低降低得愈多。

PEG分子量大小对多肽、蛋白质保护作用影响和对其体外生物活性影响是相互矛盾。49/68PEG修饰降低生物活性原因直接修饰在活性部位。PEG位阻作用。从热力学原理分析，多肽PEG化后其平动和转动熵增加是使其活性降低普适原因

。50/68用大分子量PEG修饰多肽（文件中采取）（粗线代表多肽，细线代表PEG）

用小分子量PEG修饰强疏水性多肽聚集和与受体作用51/68Self-assemblyofPEGylatedpeptidesandshieldingeffectbyPEGshell

52/68多肽固相合成及其PEG化MAGLLALILWIKRKR-NH2

mPEG750-MAmPEG750-GLLALILWIKRKR-NH2mPEG1100-MAmPEG1100-GLLALILWIKRKR-NH253/68TEMimagesofmPEG750-MA(a)andmPEG1100-MA(b)aggregates

54/68DegradationprofilesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MAincubatedwithchymotrypsin(3.64

g/mL)atpH4.5and37C

55/68DegradationprofilesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MAincubatedwith20%bovinecalfserumat37

C

56/68AntimicrobialactivitiesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MA

57/68药品靶向释放58/68药品控制释放缓释

在一定