药物分析学 第六章 药物的含量测定

总论第六章药物的含量测定药物分析学目录第一节概述1第二节容量分析2第三节分光光度法3第四节色谱法4第五节含量测定方法验证52本章学习要求熟悉药物及其制剂的含量限度表示方法掌握容量分析滴定反应原理与含量计算方法；熟悉常用滴定剂、相应的基准物质和指示剂掌握HPLC法和GC法的系统适用性试验、含量计算；熟悉常用HPLC、GC色谱柱、检测器、条件的选择掌握UV法测定药物含量的原理与计算方法；熟悉紫外-可见分光光度仪的检定方法；了解荧光分光光度法和原子吸收分光光度法测定药物含量的原理与应用熟悉药物含量测定分析方法的验证实验3第一节概述药物的含量是药物质量的主要指标含量测定（assay）——理化方法测定效价测定（assayofpotency）——生物学方法或酶学方法测定化学原料药的含量测定：强调测定结果的精密度制剂的含量测定：偏重方法的选择性4药典对药物的含量限度的表示方法原料药：以%表示（一般以干燥品计）

凡未规定上限的，药典凡例中规定，其含量上限不得超过101.0%①按原料药本身形式计算其含量②由于药物组成不定，需以另一种稳定形式计算含量zhuo5举例地塞米松磷酸钠

——按干燥品计算，含C22H28FNaO8P应为96.0%-102.0%。硫酸庆大霉素

——按无水物计算，每1mg的效价不得少于590庆大霉素单位。阿司匹林——含C9H6O4不得少于99.5%

氢氧化铝——含氢氧化铝按Al2O3计算，不得少于48.0%。6制剂的含量限度表示方法：①按标示量计算②直接用%含量规定范围③以重量规定含量范围 标示量=规格量=处方量例：维生素B1注射液含维生素B1

应为标示量的95.0%～105.0%例：复方碘溶液含I应为4.50%～5.50%

含KI应为9.5%～10.5%例：复方磺胺甲噁唑片磺胺甲噁唑0.360～0.440g/片甲氧苄氨嘧啶72.0～88.0mg/片7常用含量测定方法(2005年版ChP）仪器法容量法其他法HPLC29.4%非水法15.3%生物学8.1%VIS-UV21%酸碱法7.5%重量法0.8%旋光0.5%银量法3.4%原子吸收0.3%碘量法3.3%GC0.3%EDTA法2.9%荧光0.1%亚硝酸钠法2.1%其他容量法5%8一、含量计算原料药及以%表示的制剂

直接滴定法样品%=V×F×T/W×100%滴定度T——与1ml规定（理论）浓度的标准溶液所相当的被测物的mg数.T=（M被测物

/a）×mol/L标准液（理论）a为与1摩尔被测物相当的标准液摩尔数。第二节容量分析法浓度校正因子F=N实/N理9剩余滴定法样品%=（V空白－V样

)×F×T/W×100%方法：样品+标准液1（过量定量）剩余的标准液1+标准液2回滴定→V2样空白+标准液1（同样量）剩余的标准液1+标准液2回滴定→V2空白10片剂：V×F×T/W××100%针剂：

V×F×T/W××100%以重量/片计的计算公式

V×F×T/W×平均片重=重量/片相当于标示量%的计算公式平均片重标示量标示量1片粉重注射液体积11例1异烟肼含量测定称取异烟肼约0.25g，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取25mL，加水50mL与盐酸20mL，加甲基橙指示液1滴，用溴酸钾滴定液(0.01667mol/L)缓缓滴定至粉红色消失。已知：异烟肼取样0.2545g，消耗溴酸钾滴定液(F=1.005)18.30mL，每1mL溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）相当于3.429mg异烟肼。样品%=V×F×T/W×100%

18.30×1.005×3.4290.2545/100×25×1000

×100%=99.1%=12取本品约0.1g,精密称定（0.1022g)，置250ml碘量瓶中，加水10mL，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25mL，再加盐酸5mL，立即密塞并振摇1分钟，暗处静置15分钟后，微开瓶塞，加碘化钾试液10mL，立即密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）15.73mL，空白试验消耗23.21mL，每1mL溴滴定液（0.05mol/L）相当于13.01mg的司可巴比妥钠，硫代硫酸钠滴定液F=1.038。例2司可巴比妥钠的含量测定：样品%=（V空白－V样

)×F×T/W×100%

(23.21-15.73)×1.038×13.010.1022×1000

=98.8%×100%=13思考题溴滴定液是如何配制的？在本方法中需要标定吗？在滴定反应中，加盐酸后溴滴定液起了怎样的化学反应？空白试验在本方法中起什么作用？为什么要待近终点时加入淀粉指示液？滴定度T=13.01mg的由来？14取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于葡萄糖酸钙1g），置100ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，加水75ml,加氢氧化钠试液15ml，用EDTA滴定液（0.05mol/L）滴定。每1mLEDTA滴定液（0.05mol/L）相当于22.42mg的C12H22CaO14·H2O。已知：20片重12.0640g，取片粉1.2058g，消耗EDTA滴定液(0.0501mol/L)11.22mL，规格0.5g/片例3葡萄糖酸钙片含量测定规定取样量/规格=应称取片粉/平均片重可称取范围：应称取量

10%11.22×22.42×(0.0501/0.05)12.064/201.2058×25/100

×10000.5

×100%=100.9%×1315二、酸碱滴定法滴定类型——多为强酸强碱滴定弱碱弱酸药物，以盐酸、硫酸、氢氧化钠为滴定剂溶剂——根据药物的酸碱性、溶解度、稳定性等性质，选用水、中性乙醇等为溶剂应用——以水为溶剂：枸橼酸以中性乙醇为溶剂：芳酸类、磺酰胺类药物指示剂、滴定剂——酚酞，氢氧化钠滴定液16三、非水溶液滴定法本法主要用于测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量，也用于测定某些有机弱酸的含量药典收载了两种方法：第一法为测定有机弱碱及其盐类第二法为测定有机弱酸及其盐类17常用非水溶剂种类溶剂种类最常用溶剂特性酸性溶剂冰醋酸，醋酐，甲酸可增强有机弱碱的相对碱度碱性溶剂乙二胺、乙醇胺、二甲基甲酰胺可增强有机弱酸的相对酸度两性溶剂甲醇、乙醇兼有酸碱两性，用作不太弱的酸碱物质的介质惰性溶剂苯，三氯甲烷，二氧六环无酸碱性，常与上述溶剂混合使用，增加滴定突跃和试样的溶解性18第一法（非水碱量法）精密称取供试品适量[约消耗高氯酸滴定液（0.1mol/L）8mL]，加冰醋酸10～30mL使溶解，加各药品项下规定的指示液1～2滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定。终点颜色应以电位滴定时的突跃点为准，并将滴定的结果用空白试验校正影响因素：温度、水分、溶剂的选择、指示终点方法以及被测物酸根等19温度影响滴定与标定时的温度差别：超过10℃，则应重新标定若未超过10℃，根据公式校正冰醋酸的膨胀系数t1为滴定时温度t0为标定时温度N0为t0时高氯酸滴定液的浓度N1为t1时高氯酸滴定液的浓度20水分影响反应体系中不应有水，因为水既是质子的受体，又是质子的供体，可与弱酸弱碱发生竞争，影响终点判断21溶剂选择对于不同碱性的杂环类药物只有选择合适的溶剂和指示终点方法才能获得满意的滴定结果杂环类药物Kb10-8～

10-1010-10～10-12<10-12合适的溶剂冰醋酸冰醋酸-醋酐醋酐冰醋酸中加入不同量甲酸也能增大突跃范围22常用指示剂（结晶紫）结晶紫为多元弱碱，在不同pH中显示不同的颜色变化，滴定不同强度的碱性药物时终点颜色不同滴定碱性较强的药物时，终点以蓝色或蓝绿色为主滴定碱性较弱的药物时，一般以绿色为终点滴定更弱的碱性药物时，终点颜色为黄色在确定指示剂的终点颜色变化时应以电位法为对照

黄→黄绿→绿→蓝绿→蓝→蓝紫→紫pH低---------------------------------→高碱式色酸式色23各种酸根的影响冰醋酸溶液中各酸根的酸性强弱如下：高氯酸﹥

氢溴酸﹥硫酸﹥盐酸﹥

硫酸氢根﹥硝酸﹥磷酸、有机酸采取措施：HX——加HgAc2→HgX2

H2SO4——生物碱的硫酸盐通常为2分子生物碱与1分子硫酸成盐,可直接滴定至HSO-4

（注意摩尔比）HNO3

——可氧化指示剂，改用电位法磷酸、有机酸——无需处理，直接滴定24应用胺类药物：盐酸利多卡因，重酒石酸去甲肾上腺素，盐酸克仑特罗、硫酸沙丁胺醇等含氮杂环类药物：氢溴酸东莨菪碱、硫酸奎宁、硝酸毛果芸香碱、马来酸氯苯那敏等；维生素类药物：维生素B125第二法（酸量法）滴定液——甲醇钠、甲醇锂、氢氧化四丁基胺溶剂——二甲基甲酰胺注意——滴定过程中应防止溶剂和碱滴定液吸收大气中的二氧化碳和水蒸气，以及滴定液中溶剂的挥发应用——异维A酸、苄氟噻嗪、环吡酮等26银量法碘量法和溴量法亚硝酸钠法络合滴定法直接滴定、剩余滴定、置换滴定27费休氏水分测定法（KarlFischerTitration）

本法为非水氧化还原滴定反应，采用的滴定液称费休氏试液，由碘、二氧化硫、吡啶和无水甲醇组成。利用碘氧化二氧化硫时需要一定的水分参加反应反应可逆，用吡啶吸收生成的HI和SO3，形成氢碘酸吡啶和硫酸酐吡啶。但硫酸酐吡啶不稳定，无水甲醇可使其转变成稳定的甲基硫酸氢吡啶28方法与计算测定方法：精密称取供试品适量（约消耗费休氏试液1

5ml），除另有规定外，溶剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定。或将供试品置干燥的具塞玻瓶中，加溶剂2

5ml，在不断振摇（或搅拌）下用费休氏试液滴定至溶液由浅黄色变为红棕色，或用永停滴定法指示终点，另作空白试验，按下式计算：供试品中水分(%)=（VaVb）FW

100%本法专属性强，准确度高，适用于受热易被破坏的药物的水分测定，如抗生素类药物的水分测定2629注意事项：（1）每1ml新配的费休氏试液约相当于5mg的水，由于试液不稳定，逐渐变质，因此费休氏试液需在临用前1h内标定。一般F值应在4.0mg/ml以上，当F值降低到3.0mg/ml以下时，滴定终点不敏锐，不宜再用。（2）本法测定结果的精确度取决于多种因素，如试剂成分的相对浓度、溶解样品的溶剂性质、操作技术、空气湿度等，尤其是测定系统中的水分。因此必须严格规范操作，所用仪器必须干燥，并能避免空气中水分的侵入，操作宜在干燥处进行，并注意避光，整个操作应迅速，不应在阴雨天或空气湿度太大时进行测定。30第三节光谱分析紫外分光光度法（一）仪器校正与检定

波长校正：用汞灯中的较强谱线或仪器中氚灯的486.02nm、656.10nm谱线进行校正吸收度的准确度检定：测定重铬酸钾的硫酸溶液在规定波长处的吸收系数进行检定杂散光的检查：用碘化钠，亚硝酸钠溶液测定规定波长处的透光率（二）对溶剂的要求

——以空气为空白（空白光路中不置任何物质）测定溶剂的吸光度（使用波长附近应符合规定）31（三）测定法测定波长核对（规定波长

2nm内），并以吸光度最大波长为测定波长吸收度读数范围（0.3

0.7）同批溶剂为空白试验（校正比色皿和空白溶剂的吸收）测定方法吸收系数法对照品比较法计算分光光度法比色法32百分吸收系数法A=E1%cm×C×LC（%）=A/E1%cm

样品%=F=稀释倍数和浓度换算因子，W=取样量A×FE1%cm×WE值的大小反映了药物对某一波长光的吸收能力，也反映了测定反应的灵敏度。采用E法测定含量时，一般取三位有效数字表示，E值小于100的一般不宜采用330.390×10×100393×0.0105=含量%×100例1己酸孕酮称取己酸孕酮0.0105g,加无水乙醇溶解后,置10ml容量瓶中,稀释至刻度,摇匀。吸取1.00ml,置100ml容量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,置1cm吸收池内进行测定,根据下列已知条件,求出按干燥品计算的己酸孕酮百分含量。A=0.390,E1%1cm=393×100%34吸收系数（E1%cm）测定方法精密称取被测物对照品适量（双份），加溶剂制成一定浓度的溶液，使吸光度在0.6～0.8之间精密吸取适量，用同批溶剂将溶液稀释一倍在规定波长分别测定高低浓度的溶液，计算吸收系数（E）值，要求：在五种不同型号的紫外仪上测定同一台仪器测定二份间结果的偏差应不超过1.0%各台仪器测得的E值，RSD应不超过1.5%取平均值为该药物的吸收系数（注明测定时温度）35对照品比较法A样/A对

=C样/C对样品%=A样/A对

×C对×F/W×100%F=稀释倍数，W=取样量双波长法，差示法，荧光法，均可应用此公式，以△A，荧光强度代替吸收度A36例2盐酸吗啡片与注射液本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于盐酸吗啡10mg)置100ml量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，置50ml量瓶中，加0.2mol/L氢氧化钠25ml，用水稀释至刻度，摇匀，UV法测定。另取吗啡对照品适量，精密称定，用0.2mol/L氢氧化钠稀释至每ml中约含20ug的溶液，同法测定。计算，结果乘以1.317，即得C17H19NO3·HCl·3H2O的含量.(规格5mg)A样×C对×50×100×1.317×片重

A对×15×取样×1000×5×100%1.317=M

3H2O/M=375.85/285.3437方法的特点与影响因素特点：简便、快速、灵敏（10-4～10-7g/ml）、有一定专属性和准确度（相对误差2%左右），应用范围广（制剂含量、溶出度、含量均匀度测定），仪器价廉易普及影响因素：溶剂、溶液pH值普鲁卡因去氧肾上腺素38（三）计算分光光度法双波长分光光度法（复方磺胺类药物的测定）三点校正法（维生素A的）解线性方程组法等使用时应注意，当在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定吸光度时，波长的微小变化可对测定结果造成显著影响

39（四）比色法在药物分析中应用的比色法：酸性染料比色法（含氮碱性药物如：硫酸阿托品片、氢溴酸东莨菪碱片的测定）四氮唑比色法、异烟肼比色法和Kober反应法（甾体激素类药物）蛋白质的双缩脲反应（硫酸软骨素的测定）总黄酮、总生物碱的测定（中药制剂）40二、荧光分光光度法（FluorescenceSpectrophotometry）

荧光法测定的是物质分子的发射光谱。在一定条件下，物质的浓度与其荧光（也称发射光）强度成正比关系，可用于定量分析测定方法

——对照品对照法

Cx=Rx－RxbRr－Rrb×Cr荧光分析中，药物的浓度与相应的荧光读数之间的线性范围较窄，故(Rx－Rxb)/(Rr－Rrb)应在0.5～2，如超出此范围，应调节溶液浓度后再测定41荧光分析法的特点灵敏（检测限可达10-10～10-12g/ml）专属（

ex和

em）适于低浓度溶液分析。浓度过大，荧光会发生“自熄灭”现象，导致荧光强度与溶液浓度不成正比干扰因素多，如溶剂种类与纯度、溶液pH、温度，共存物质、溶液中的悬浮物、玻璃仪器的洁净度等，因此必须做空白试验常用基准溶液校正仪器，如：硫酸奎宁的稀硫酸溶液（蓝色荧光）荧光素钠水溶液（黄绿色荧光）罗丹明B水溶液（红色荧光）42三、原子吸收分光光度法（AtomicAbsorptionSpectrophotometry，AAS）原理——由待测元素作为阴极的空心阴极灯发出的特征谱线，通过供试品经原子化产生的原子蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，测定该特征谱线辐射光强度减弱的程度，求出供试品中待测元素的含量遵循一般分光光度法的吸收定律。用于呈原子状态的金属元素和部分非金属元素的测定含量测定方法采用标准曲线法和标准加入法43标准曲线法制备含待测元素的对照品溶液至少3份，浓度依次递增，并分别加入各品种项下制备供试品溶液的相应试剂，同时以相应试剂制备空白对照液依次测定空白对照液和各浓度对照品溶液的吸光度，记录读数（3次），绘制标准曲线制备供试品溶液，测定吸光度，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计算元素的含量44标准加入法取同体积按规定制备的供试品溶液4份，分别置4个同体积的量瓶中除1号量瓶外，其他量瓶分别精密加入不同浓度的待测元素对照品溶液,分别用去离子水稀释至刻度制成从零开始递增的一系列溶液供试液取用量中待测元素的含量45AAS法的局限性主要是工作曲线的线性范围较窄，一般为1个数量级；每测一种元素需要更换1个灯，对于多种元素同时测定时非常不便4246第四节色谱分析一、HPLC法根据固定相与流动相的极性大小，分为：

NP-HPLC——以吸附机理为主

RP-HPLC——以分配机理为主RP-HPLC法适合于中等极性或非极性的弱酸、弱碱和中性化合物的分离分析绝大部分药物均可用RP-HPLC法进行分析47色谱柱与流动相RP-HPLC色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18、C8柱、氨基柱、氰基柱等流动相：甲醇-水（或缓冲盐）、乙腈-水（或缓冲盐）、四氢呋喃-水（或缓冲盐）（过滤脱气）洗脱力强弱依次为四氢呋喃

乙腈

甲醇

水化学键合固定相适用pH2

8的流动相；C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故流动相中有机溶剂的比例应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值的变化，造成色谱系统不稳定用过缓冲盐或酸碱流动相后，色谱柱必须用低浓度甲醇液冲洗，以除去酸碱盐，然后再用甲醇冲洗48色谱条件选择调节流动相中有机溶剂比例可调整被测物的保留时间，近似规则：流动相中有机溶剂降低10%，溶质的容量因子约增加3倍40%甲醇的强度

33%乙腈

23%四氢呋喃也可用三种、四种混合溶剂作为流动相例如

×49NP-HPLCNP-HPLC——硅胶柱流动相溶剂有：正己烷-异丙醇；正己烷-乙醇；正己烷-二氯甲烷等洗脱力强弱依次为乙醇

异丙醇

二氯甲烷

正己烷正

反相色谱相互转换时，须用过渡溶剂依次冲洗如由反相→正相时，依次用甲醇

异丙醇

正己烷冲洗而由正相→反相时，则以反方向进行冲洗50检测器选择性检测器紫外、二极管阵列（DAD）、荧光、电化学响应值与待测液浓度有关，还与化合物结构有关通用型检测器示差折光、蒸发光散射检测器对所有的化合物均有响应更专属、更灵敏的检测器——质谱不同检测器对流动相的要求不同，如紫外检测器应考虑有机溶剂的截止使用波长蒸发光散射检测器和质谱检测器不允许使用含不挥发盐组分的流动相51柱效分离度拖尾因子重复性取对照溶液，连续进样5次，测得峰面积相对标准差RSD应小于2.0%(T=0.95～1.05)系统适用性试验系统的精密度：每次开机后，首先要做的日常工作，不能作为分析方法学研究中的精密度试验52色谱参数测量为满足系统适用性试验要求，可以改变一些条件，如色谱柱内径、长度、牌号、载体粒度、流动相流速、组成比例、柱温等，但不能改变固定相种类，流动相组成和检测器类型53测定方法与应用定量方法——内标法和外标法HPLC法是药物制剂、多组分样品分析的首选方法，是各国药典收载的方法中应用最广的方法在原料药的含量测定中，HPLC法主要用于多组分抗生素或生化药品，或因所含杂质的干扰测定，而常规方法又难以分离或分离手段繁杂的化学品种。如：庆大霉素的组分测定，

-内酰胺类、大环内酯类、四环素类等抗生素的含量测定甾体激素类药物的含量测定54例醋酸氢化可的松的含量测定取对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每1mL中约含0.35mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液（0.30mg/mL炔诺酮甲醇溶液）各5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10

L注入液相色谱仪。另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样36.2mg，样品取样35.5mg，测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品液中两者的峰面积分别为5221345和6122845，求本品含量？5221345/61228455467