第3章 DNA的复制课件

第三章DNA的复制

本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。

思考

DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制遗传信息传递的中心法则

蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。第3章DNA的复制目录第一节DNA生物合成第二节DNA的损伤与修复第三节DNA突变第四节DNA的遗传重组楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA体内复制：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）DNA的体外复制：分子克隆。DNA生物合成有两种方式1.DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）2.逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA的复制一、概念和实验依据二、DNA聚合反应有关的酶类三、DNA的复制的起始点和方式四、原核细胞DNA的复制过程五、DNA复制的忠实性六、真核细胞DNA的复制

第3章DNA的复制

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconservativereplication)

。DNA的半保留复制的概念第3章DNA的复制DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA的半保留复制实验依据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制第3章DNA的复制复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Cairns实验)将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分占整个染色体的三分之二，其中一条双链（B）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。ABC环状DNA的复制

ABC第3章DNA的复制第3章DNA的复制原核生物DNA聚合反应有关的酶类

(1)DNA聚合酶(DNApolymerases)(2)引物酶(primase)和引发体(primosome)：启动RNA引物链的合成。(3)DNA连接酶（DNAligase）(4)DNA解链酶(DNAhelicase)(5)单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSBP)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。(6)拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物第3章DNA的复制大肠杆菌的引物酶也是DNA复制所必需的一种酶。该酶由一条多肽链组成，MW为60KD，每个细胞中有50-100个分子由大肠杆菌的dnaG基因编码。引物酶催化引物RNA分子的合成，但它和传统的RNA聚合酶不一样。[1]引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感;[2]引物酶既可以利用核糖核苷酸，而RNA聚合酶只能利用核糖核苷酸;[3]引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。但在单链噬菌体M13DNA和质粒Co1E1DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌体T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类，大肠杆菌的ε蛋白(MW-110000)就是一种典型的拓扑异构酶Ⅰ.它的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，然后再将切断的单链DNA连接起来，而不需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase)则是典型的拓扑异构酶Ⅱ，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制单链DNA结合蛋白(SSBP)螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体现相邻的单链DNA结合，这个过程称为协同结合(cooperativebinding)，SSBP结合到单链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA作为模板。SSBP可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。第3章DNA的复制螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打开双链。螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种螺旋酶参与这个过程，一种称为螺旋酶Ⅱ或螺旋酶Ⅲ，与前导链的模板DNA结合沿5'→3'方向运动;第二种称为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿3'→5'方向运动。第3章DNA的复制DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´3´5´模板链第3章DNA的复制DNA聚合酶(DNAPolymerase)共同性质[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;[2]需要模板和引物的存在;[3]不能起始合成新的DNA链;[4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端;[5]催化DNA合成的方向是5'→3'。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比较项目DNA聚合酶Ⅲ切除引物修复修复复制功能1999年发现聚合酶

和

，它们涉及DNA的错误倾向修复（error-pronerepair）第3章DNA的复制大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)大肠杆菌每个细胞中只有10-20个DNApolⅢ分子，该酶对模板的要求与DNA聚合酶Ⅱ相同，最适模板也是链DNA中间有空隙的单链DNA，单链结合蛋白可以提高该酶催化单链DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶活性的最适底物是单链DNA，只产生5'-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3'端开始切除一个核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。第3章DNA的复制大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)1970年发现了DNApolⅡ。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%。

(1)聚合作用:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。对于较长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。(2)该酶具有3'→5'外切酶活性，但无5'→3'外切酶活性。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制(3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2－脱氧核苷酸掺入到DNA链中。(4)该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ这是1956年由ArthurKornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornberg酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。DNAPolⅠ在空间结构上近似球体，直径约6.5nm。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟(cleft)，带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点:[1]模板DNA结合位点;[2]DNA生长链或引物结合位点;[3]引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3'-OH;[4]脱氧核苷三磷酸结合位点;[5]5'→3'外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5'-端脱氧核苷酸并切除之;[6]3'→5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的第3章DNA的复制[1]聚合作用在引物RNA3'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制[2]3'→5'外切酶活性──校对作用这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制第3章DNA的复制[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用从5’→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5’-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。第3章DNA的复制[4]焦磷酸解作用DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi→(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA[5]焦磷酸交换作用催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA（[4]、[5]两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。）第3章DNA的复制DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nicktranslation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApolIⅠ能从切口开始合成新的NDA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能

延长因子DNA聚合酶Ⅲ两个亚基夹住DNADNA聚合酶Ⅲ异二聚体核心酶校对引物的结合和识别促使核心酶二聚化第3章DNA的复制连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链第3章DNA的复制DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。(1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。(2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5'-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸;(3)这个被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。第3章DNA的复制环状DNA复制时所形成的θ结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制DNA的双向和单向复制第3章DNA的复制定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。复制方向★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度DNA的几种复制方式楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA的几种复制方式楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制亲代双链（或单链）DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，其5'端游离出来。DNA聚合酶Ⅲ便可以将脱氧核糖核苷酸聚合在3'-OH端。当复制向前进行时，亲代DNA上被切断的5'端继续游离下来，并且很快被单链结合蛋白所结合。因为5'端从环上向下解链的同时伴有环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3'-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸，因而称为滚环(Rollingcircle)复制。第3章DNA的复制在这种复制方式中，DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。这么长的DNA链是如何转变为单位长度的DNA分子的，目前尚不清楚。可能是由特异的内切酶切开产生单位长度的子代DNA。这些DNA可自身环绕，或保持线性分子状态。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明复制起点是以一条链为摸板起始合成DNA的一段序列；两条链的起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D－环（D-loop）复制。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制多复制叉复制第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制不需要RNA引物的DNA复制有些病毒的基因组是线性DNA，在原核细胞和真核细胞中复制时不需要RNA引物。目前了解最清楚的是腺病毒DNA和枯草杆菌噬菌体φ29DNA的复制。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制在这些DNA复制时，从一端开始，只能利用一条DNA链作为模板，即以3'→5'链为模板。这样，新合成的DNA链便将原来的亲代DNA链取代子链。原来的亲代DNA链(从合成起始端看是5'→3'链)作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的5'和3'可以互补配对，然后在3'端开始以此链为模板重新合成另一条子链。这样，DNA复制即完成。产生两个与亲代DNA完成一样的子代DNA。第3章DNA的复制DNA聚合酶不能从头开始合成DNA链，需要有引物才能聚合核苷酸生成DNA链。那么，腺病毒和φ29DNA等没有RNA引物是怎样启动其DNA复制的呢?研究发现，所有的腺病毒DNA生长链上都有一个特异的蛋白质分子附着在其5'末端的胞嘧啶核苷酸上。在DNA复制开始之前，该末端蛋白质通过共价键与dCMP的5'磷酸基相连。胞嘧啶通过碱基配对与腺病毒DNA模板3'末端的鸟嘌呤核苷酸配对结合，然后由病毒本身编码的DNA聚合酶以此末端蛋白-dCMP复合物为引物连续合成腺病毒整个基因组的36000个核苷酸，在DNA复制过程中，由于DNA链被置换而产生了扭曲张力(torsionalstrain)，但细胞内拓扑异构酶Ⅰ可以消除张力。病毒自身编码的72KD的单链结合蛋白可能也同时具有螺旋酶的功能促进DNA双链的解开。第3章DNA的复制DNA的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如D环复制）。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，富含A－T。

楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制）。环状DNA的复制眼象θ，称θ形复制。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。第3章DNA的复制用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体DNA的复制起点oriC在基因图谱上的位置。在一个生长的群体中几乎所有的染色体都在复制过程中，因此离复制起点越近的基因出现频率越高，越远的基因出现频率越低。将大肠杆菌提取出来的DNA切成大约1％染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明oriC位于基因图谱的ilv位点处。一旦复制开始以后，复制叉向两侧以相等速度向前移动，两个复制又在起点180°的trp位点处(33分附近)相会合。第3章DNA的复制大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型第3章DNA的复制原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始（引发）DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´DNA复制动画1、2第3章DNA的复制DNA新生链的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必须由螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。有两种机制可以防止这种现象发生:[1]DNA在生物细胞中本身就是超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;[2]DNA拓扑异构酶Ⅰ可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。第3章DNA的复制在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶Ⅲ在同一时间分别进行复制DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制这样，当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体(replisome)。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5'→3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5'→3'合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制复制的引发(Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3‘-OH末端复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n'蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。第3章DNA的复制首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5'→3'方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。第3章DNA的复制为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）第3章DNA的复制大肠杆菌染色体复制的终止oric复制叉2复制叉1终止复制叉2终止复制叉1复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶

连锁染色体第3章DNA的复制复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物体引物体解旋酶解旋酶第3章DNA的复制复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5

109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:

DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为10-4～10-5）

DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3'

-5'外切酶切除）

起始时以RNA作为引物第3章DNA的复制DNA聚合酶的校对功能

楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸第3章DNA的复制起始时以RNA作为引物的作用

DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有3’5’外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以5’3’外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制真核细胞DNA复制的特点

多个起点复制起点起点起点起点起点起点

真核生物的DNA聚合酶

端粒（telemere）复制第3章DNA的复制真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亚基数细胞内分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23，000多个细胞核～80%无120，000一个细胞核和线粒体2%

～15%无-400，000一个细胞核+10%～25%

5’-3’外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45，000一个细胞核10%～15%无楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶第3章DNA的复制端粒合成的一种模型3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5´3´nAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTCCCCTnAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn进一步加工继续延伸动画第3章DNA的复制楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制真核和原核DNA细胞复制比较楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制第二节

DNA的损伤与修复

某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤。DNA的修复主要有以下类型:暗修复四、诱导修复（SOS修复）一、回复修复二、切除修复三、重组修复

楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA损伤的原因（一）DNA分子的自发性损伤1、DNA复制中的错误校正后的错配率仍约在10-10左右。2、DNA的自发性化学变化①碱基的异构互变DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化（例如烯醇式与酮式碱基间的互变），这种变化就会使碱基配对间的氢键改变，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等，如果这些配对发生在DNA复制时，就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤。第3章DNA的复制②碱基的脱氨基作用:碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤（H）、鸟嘌呤会变成黄嘌呤（X）等，遇到复制时，U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制③脱嘌呤与脱嘧啶自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37℃条件下，20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个；估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞（如神经细胞）在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108，这占细胞DNA中总嘌呤数约3%。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制④碱基修饰与链断裂细胞呼吸的副产物O2-、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。此外，体内还可以发生DNA的甲基化，结构的其他变化等，这些损伤的积累可能导致老化。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制（二）物理因素引起的DNA损伤1、紫外线引起的DNA损伤DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当DNA受到最易被其吸收波长（~260nm）的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环（cyclobutanering）连成二聚体，其中最容易形成的是TT二聚体。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5×104/细胞，但只局限在皮肤中，因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后，就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制2、电离辐射引起的DNA损伤电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤，间接效应是指DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。电离辐射可导致DNA分子的多种变化：①碱基变化主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。②脱氧核糖变化脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制③DNA链断裂这是电离辐射引起的严重损伤事件，断链数随照射剂量而增加。射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂。DNA双链中一条链断裂称单链断裂（singlestrandbroken），DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂（doublestrandbroken）。虽然单断发生频率为双断的10-20倍，但还比较容易修复；对单倍体细胞（如细菌）一次双断就是致死事件。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制④交联包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联。同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合，DNA与蛋白质之间也会以共价键相连，组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。这些交联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和DNA复制。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制（三）化学因素引起的DNA损伤1、烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤：①碱基烷基化。烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化，例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对、而改与胸腺嘧啶配对，结果会使G-C转变成A-T。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制②碱基脱落。烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。③断链。DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。④交联。烷化剂有两类，一类是单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；另一类是双功能基烷化剂，化学武器如氮芥、硫芥等、一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等、某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两处烷基化，结果就能造成DNA链内、DNA链间、以及DNA与蛋白质间的交联。第3章DNA的复制2、碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。由于其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基掺入到DNA链中而干扰DNA复制合成，例如5-BU结构与胸腺嘧啶十分相近，在酮式结构时与A配对，却又更容易成为烯醇式结构与G配对，在DNA复制时导致A-T转换为G-C。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专一修饰DNA链上的碱基或通过影响DNA复制而改变碱基序列，例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对；羟胺能使T变成C，结果是A-T改成C-G对；黄曲霉素B也能专一攻击DNA上的碱基导致序列的变化，这些都是诱发突变的化学物质或致癌剂。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制DNA损伤的后果①点突变（pointmutation）指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。②缺失（deletion）指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。③插入（insertion）指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（readingframeshift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shiftmutation）。第3章DNA的复制④倒位或转位（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。⑤双链断裂已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。突变或诱变对生物可能产生4种后果：①致死性；②丧失某些功能；③改变基因型（genotype）而不改变表现型（phenotype）；④发生了有利于物种生存的结果，使生物进化。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制回复修复这是较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样。1.光修复2.单链断裂的重接3.碱基的直接插入4.烷基的转移楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制烷基的转移在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制碱基的直接插入

DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）识别结合，在K+存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的硷基严格配对，使DNA完全恢复。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制单链断裂的重接

DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶（ligase）参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂缺几乎不能修复。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制1.光修复这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300-600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。第3章DNA的复制切除修复（excisionrepair）是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5'侧切开磷酸二酯键。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。②由5'—3'核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5'—3'方向DNA链，填补已切除的空隙。④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。第3章DNA的复制DNA的损伤和切除修复碱基丢失碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶AP核酸内切酶核酸外切酶切开切除修复连接糖苷酶插入酶碱基取代第3章DNA的复制DNA的重组修复①受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。②完整的另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。③以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。第3章DNA的复制SOS反应的机制“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-pronerepair），使细胞有较高的突变率。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国第3章DNA的复制当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除