胚胎工程实验技术

胚胎工程实验技术(4)胚胎发育过程中开始分化的阶段是囊胚,可以移植或分割的阶段为桑椹胚和囊胚。

(5)防止多精入卵的两道屏障的名称——透明带反应和卵黄膜的封闭作用。

受精标志：在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时。受精完成的标志：精卵细胞核融合形成合子第2页,共70页，2024年2月25日，星期天2.对卵裂阶段物质含量和体积大小的变化模糊不清

(1)卵裂阶段的细胞分裂方式——有丝分裂。

(2)受卵膜制约，从受精卵到囊胚阶段总体积不变或略有减小，所以每个细胞体积减小。

(3)伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中DNA含量保持相对稳定。

(4)该过程中有机物总量减少，因为一直呼吸消耗但不从外界吸收。第3页,共70页，2024年2月25日，星期天第二节胚胎工程实验技术-------人工受精和胚胎体外培养第4页,共70页，2024年2月25日，星期天1978年7月26日，世界首例试管婴儿“路易斯．布朗”在英国诞生，现已成为母亲。第5页,共70页，2024年2月25日，星期天1988年3月10日我国首例试管婴儿第6页,共70页，2024年2月25日，星期天1992年我国首例三胞胎试管婴儿第7页,共70页，2024年2月25日，星期天1.试管婴儿和母亲正常怀孕，生产的过程有何异同？思考与讨论答：

相同之处：都通过有性生殖产生，在母体子宫内发育形成胎儿。不同之处：受精作用在体外，并在体外发育成早期胚胎进行胚胎移植。第8页,共70页，2024年2月25日，星期天2.试管婴儿用到了什么生物技术？思考与讨论答：包括体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植技术。第9页,共70页，2024年2月25日，星期天分类：人工体内受精、人工体外受精、显微受精人工体内受精：人工将精子注射到雌性动物宫颈管内人工体外受精：简称体外受精，采取雌性动物的（卵细胞）和雄性动物的（精子），使其在（试管）中受精。显微受精：将完整的精子或精核用显微操作仪注入卵周隙或卵胞质，激活卵母细胞并完成受精一、人工受精第10页,共70页，2024年2月25日，星期天显微受精显微受精过程不受精子数量、活力等因素的影响第11页,共70页，2024年2月25日，星期天1、概念：

是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。二、试管动物技术第12页,共70页，2024年2月25日，星期天2、目的：快速繁殖动物优良品种3、技术手段：体外受精和早期胚胎培养4、过程：体外受精胚胎的早期培养胚胎移植二、试管动物技术第13页,共70页，2024年2月25日，星期天试管动物供体公牛精子供体母牛的卵子精子体外获能卵子的体外培养体外受精体外胚胎培养胚胎移植受体母牛子宫产仔第14页,共70页，2024年2月25日，星期天三、体外受精1、卵母细胞的采集和培养（1）用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后从输卵管中冲取卵子，直接与获能精子在体外受精；第15页,共70页，2024年2月25日，星期天三、体外受精1、卵母细胞的采集和培养（2）对大家畜或大型动物：从已经屠宰的卵巢中采集卵母细胞；（3）借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等工具，直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞；第16页,共70页，2024年2月25日，星期天第17页,共70页，2024年2月25日，星期天第18页,共70页，2024年2月25日，星期天卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱第19页,共70页，2024年2月25日，星期天卵母细胞的成熟培养：CO2培养箱第20页,共70页，2024年2月25日，星期天1.卵细胞的获取获取部位：卵巢，输卵管或子宫超数排卵：人为注射外源促性腺激素（蛋白质），促进卵巢排出比正常情况下更多的卵获取方法：手术采卵：冲洗输卵管（中小型农畜及实验动物）非手术采卵：子宫冲卵（牛等大型牲畜）第21页,共70页，2024年2月25日，星期天2、精子的获取采精：人工采集（假阴道法,手握法和电刺激等）保存：加入稀释液，低温保存精子的种类：睾丸精子，附睾精子，射出精子，雌性生殖道内的精子常用：射出精子和附睾精子第22页,共70页，2024年2月25日，星期天第23页,共70页，2024年2月25日，星期天3.卵子的成熟，精子的获能（1）卵子的成熟：由于从输卵管及卵巢中取出的卵子还未成熟，必须体外培养到减数第二次分裂中期才能进行受精作用（2）精子的获能方法：培养法：人工配制的获能液中培养（啮齿动物、家兔和猪等）化学法：一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，化学药物诱导（牛、羊等）第24页,共70页，2024年2月25日，星期天获能的精子和培养成熟的卵子，一般情况下在获能溶液或专用受精溶液中完成受精过程。4.体外受精第25页,共70页，2024年2月25日，星期天四、胚胎的体外培养（胚胎工程的核心技术）

1、概念：应用人工创造的环境，对获取的早期胚胎进行体外培养。

2、培养起点：

早期胚胎，而不是受精卵。3、目的：检查受精状况和受精卵发育能力

第26页,共70页，2024年2月25日，星期天4、培养液：培养不同发育时期的胚胎时，培养液的成分不同。5、移植：不同生物有不同的适宜阶段第27页,共70页，2024年2月25日，星期天

4、早期胚胎培养液成分

:水、无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸以及动物血清等.（两盐两素两酸及血清）第28页,共70页，2024年2月25日，星期天胚胎培养发育到适宜阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植时间不同牛、羊：桑椹胚或囊胚阶段小鼠、家兔：卵裂期或囊胚阶段试管婴儿：8个或16个细胞阶段第29页,共70页，2024年2月25日，星期天思考探究1、分析超数排卵技术关键是什么？

（1）时间要求：一般要求在卵细胞具有旺盛受精能力之前冲取。（2）激素使用要求：使用促性腺激素，因为促性腺激素是蛋白质，所以只能注射而不能口服。2、思考从卵巢中采集的卵细胞为什么不能与精子直接受精？

卵巢中卵细胞不成熟，需要培养到减数第二次分裂中期时才具有受精能力。3、根据试管动物操作过程，试管动物技术是克隆吗？

不是。试管动物技术需要经过受精过程，属于有性生殖。而克隆技术是无性生殖。第30页,共70页，2024年2月25日，星期天有性生殖

无性生殖核移植技术、胚胎移植遵循

不遵循体外受精胚胎移植试管动物克隆动物生殖方式技术手段遗传物质遗传规律比较试管动物和克隆动物来自2个个体主要来自核供体

第31页,共70页，2024年2月25日，星期天二胚胎移植技术

胚胎移植（embryotransfer,ET）指从经济价值较高、遗传性状优良的母畜体内获取经激素处理超数排卵受精发育的胚胎，移植到同期发情的代孕母的子宫内，经过妊娠、产仔的技术。提供胚胎的个体称为------供体（donor）接受胚胎的个体称为------受体（recipient）第32页,共70页，2024年2月25日，星期天

本质

生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程；胚胎移植第33页,共70页，2024年2月25日，星期天（一）胚胎移植前的准备1、胚胎的采集

1）采用超数排卵技术，以增加可用卵的数量

2）利用体外授精技术培育胚胎。

3）采集方法：手术法和非手术法。

4）检出的胚胎必须在显微镜下观察，检查后完整的胚胎可移植到受体的子宫保存，整个过程迅速准确，并保持无菌操作。第34页,共70页，2024年2月25日，星期天2、供体、受体动物的准备(1)选择供体：遗传性能和生产性能优秀的个体；受体：生产性能低，健康和正常繁殖能力的个体处理：同期发情具体做法：注射相关激素。第35页,共70页，2024年2月25日，星期天供体的主要职能：

只产生具有优良遗传特性的胚胎；受体的职能：

繁重而漫长的妊娠和育仔的任务；第36页,共70页，2024年2月25日，星期天（2）配种或人工授精精子来源：同种优良的雄性动物。第37页,共70页，2024年2月25日，星期天（3）胚胎的收集

在配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来。为什么在第7天进行冲卵？卵细胞在输卵管里完成受精和第1—3次卵裂大概需7天，然后下降到子宫内发育。第38页,共70页，2024年2月25日，星期天3、胚胎的保存胚胎为什么要保存？胚胎保存的条件是什么？

短期：0℃~5℃下的培养液中暂时保存；长期保存：冷冻在液氮-196℃中液氮灌第39页,共70页，2024年2月25日，星期天（二）胚胎移植的实施方法一：手术法具体做法：引出受体子宫和卵巢，将胚胎注入子宫角，缝合创口。方法二：非手术法将装有胚胎的移植管送入受体母牛子宫的相应部位，注入胚胎。非手术法手术法第40页,共70页，2024年2月25日，星期天对受体母牛进行是否妊娠的检查第41页,共70页，2024年2月25日，星期天受体母牛产下胚胎移植的犊牛第42页,共70页，2024年2月25日，星期天选择供体母牛受体母牛……同期发情处理(性激素类）……超数排卵供体公牛配种或人工受精冲卵（胚）质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）促性激素早期胚胎处于游离（桑椹胚或囊胚）总结：第43页,共70页，2024年2月25日，星期天【归纳总结】①该过程中两次使用激素：第一次对受、供体进行同期发情处理；第二次用于供体的超数排卵。②该过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母牛是否妊娠进行检查。③产下的犊牛性状取决于所用公牛和供体牛：性别取决于公牛提供何种类型的精子，性别、性状与受体牛没有关系。④冲卵的含义是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子。第44页,共70页，2024年2月25日，星期天

生理学基础

1、哺乳动物发情排卵后，不管是否妊娠，在一段时间内同种动物的供体和受体生殖器官的生理变化是相同的。胚胎移植为供体胚胎移入受体提供相同的生理环境第45页,共70页，2024年2月25日，星期天

生理学基础2、哺乳动物的胚胎形成后处于游离状态，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系。胚胎移植为胚胎的收集提供了可能第46页,共70页，2024年2月25日，星期天

生理学基础3、受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。胚胎移植为胚胎在受体内的存活提供了可能第47页,共70页，2024年2月25日，星期天

生理学基础

4、供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但移入受体的供体胚胎，其遗传特性在孕育过程中不受任何影响。胚胎移植第48页,共70页，2024年2月25日，星期天1）充分发挥优良母畜的繁殖潜力，迅速扩大优良种群。2）是保存品种资源，建立优良种质资源基因库。3）代替优良种畜的引进。（三）、胚胎移植技术的应用第49页,共70页，2024年2月25日，星期天广州8胞胎广州8胞胎第50页,共70页，2024年2月25日，星期天三、胚胎分割阅读课本，思考以下问题：P37（1）胚胎分割的概念（2）胚胎分割特点（3）胚胎分割的理论基础（4）胚胎分割操作过程第51页,共70页，2024年2月25日，星期天

采用显微技术（机械方法）将早期胚胎切割成2等份，4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。1.概念第52页,共70页，2024年2月25日，星期天切割同卵双驹第53页,共70页，2024年2月25日，星期天优势:可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。切割同卵双犊和三卵六羔羊第54页,共70页，2024年2月25日，星期天2.特点：

后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看做动物无性繁殖或克隆的方法之一。3、理论基础：动物胚胎细胞的全能性。所以胚胎分割的时期为：囊胚或桑椹胚。4、选择的胚胎：发育良好的、形态正常的桑椹胚或囊胚。第55页,共70页，2024年2月25日，星期天5.使用的主要仪器及工具：实体（体视）显微镜、显微操作仪、胚胎固定管、分割刀、分割针。第56页,共70页，2024年2月25日，星期天6、胚胎的预处理切割前用一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。

7、胚胎分割的操作过程

胚胎移入培养液→分割胚胎（机械法、酶处理）→移植胚胎给受体→着床产仔第57页,共70页，2024年2月25日，星期天7、胚胎的分割（机械法)

用分割针或分割刀片将胚胎切开，吸出其中的半个胚胎，注入预先准备好的空透明带中，或直接将裸半胚移植给受体。第58页,共70页，2024年2月25日，星期天8.操作注意事项：

①对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割。

②胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的成功率也越低。第59页,共70页，2024年2月25日，星期天受精卵分裂

早期胚胎胚胎分割基本过程代孕母牛植入植入分割第60页,共70页，2024年2月25日，星期天

分割后要放入空透明带中，或者是用琼脂包埋移入中间受体的输卵管内，或直接在体外培养到桑棋胚或囊胚阶段。

10、分割胚胎移植

无菌操作，将发育良好的胚胎移植到受体内后，受体受孕产仔。11、胚胎分割技术的应用:

（1）扩大优良家畜的数量。（2）培育遗传特性相同的动物。（3）用于胚胎的性别鉴别。9、分割胚的培养第61页,共70页，2024年2月25日，星期天思考探究1、思考胚胎分割有什么意义？处理时期是什么？理由是什么？（1）胚胎分割的意义是提高胚胎利用率。（2）处理的时期是桑椹胚胎期或囊胚胎期，因为此时细胞具有一定的全能性。2、早期胚胎能不能无限分割？

不能。实践证明，采用胚胎分割技术产生同卵多胚胎的可能性有限，目前以二分胚胎的分割和移植效率最高。3、胚胎分割移植后产生的子代的遗传特性是否相同？为什么？相同，因为各胚胎细胞的遗传物质相同第62页,共70页，2024年2月25日，星期天浙江在线·科技新闻网2012年7月5日讯

“胚胎干细胞移植治疗糖尿病动物实验成功。”最新一期的国际期刊《糖尿病》，刊登了加拿大和美国科学家的一项研究成果。

研究发现，患有糖尿病的实验鼠在接受了胚胎干细胞移植后，成