酶促反应动力学

酶促反应动力学生化反应动力学●单底物酶反应动力学●多底物酶反应动力学●各种因素对酶反应速度的影响●微生物代谢调节的生化基础第2页,共115页，2024年2月25日，星期天生物在表观上所显示的一切生理现象(实为体内生物化学反应)都与酶的作用密切相关。因此，研究生化反应动力学也就是研究酶催化反应动力学。微生物的生长和产物的生成都是一系列复杂的酶催化反应的结果。要了解微生物发酵动力学必须首先了解酶反应动力学。酶动力学主要研究酶催化反应的速度及各种因素（包括酶浓度、底物浓度、产物、pH值、温度、抑制剂和激活剂等）对反应速度的影响，并提出从反应物到产物之间可能进行的历程。第3页,共115页，2024年2月25日，星期天单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。（[S]》[E]）研究前提一、底物浓度对酶反应速率的影响第4页,共115页，2024年2月25日，星期天产物0时间初速度酶促反应速度逐渐降低酶促反应的时间进展曲线第5页,共115页，2024年2月25日，星期天

在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。反应初速度随底物浓度变化曲线第6页,共115页，2024年2月25日，星期天当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax第7页,共115页，2024年2月25日，星期天随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax第8页,共115页，2024年2月25日，星期天当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax第9页,共115页，2024年2月25日，星期天E+SESP+Ek1k2k3（一）中间络合物学说

k4三个假设：（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即

V＝k3[ES]。（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。（3）P→0忽略这步反应第10页,共115页，2024年2月25日，星期天（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程的推导第11页,共115页，2024年2月25日，星期天1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

第12页,共115页，2024年2月25日，星期天稳态时ES浓度不变

反应速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的质量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3(Ⅲ)(Ⅰ)(Ⅱ)第13页,共115页，2024年2月25日，星期天第14页,共115页，2024年2月25日，星期天稳态时ES浓度不变反应速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度

k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的质量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3V=V[S]Km+[S]米氏方程V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et]Km=

k2+k3k1米氏常数第15页,共115页，2024年2月25日，星期天

a.当[S]很小时V=V[S]/Km一级反应反应初速度随底物浓度变化曲线米氏曲线V=V[S]Km+[S]b.当[S]很大时V=V[S]/[S]=V

0

级反应混合级第16页,共115页，2024年2月25日，星期天Km=?Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]第17页,共115页，2024年2月25日，星期天2、动力学参数的意义（1）米氏常数Km的意义Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2第18页,共115页，2024年2月25日，星期天

①Km是酶的特性常数：

与pH、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0第19页,共115页，2024年2月25日，星期天②可以判断酶的专一性和天然底物Km值最小的底物——最适底物/天然底物1/Km近似表示酶对底物的亲和力：1/Km越大、亲和力越大第20页,共115页，2024年2月25日，星期天Km=

k2+k3k1Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，亲和力越强。[S]很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要k2>>k3时第21页,共115页，2024年2月25日，星期天④Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径催化可逆反应的酶对正/逆两向底物Km不同

——Km较小者为主要底物③根据Km：判断某[s]时v与Vmax的关系判断抑制剂的类型第22页,共115页，2024年2月25日，星期天乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛丙酮酸浓度较低时：代谢哪条途径决定于Km最小的酶一底物多酶反应第23页,共115页，2024年2月25日，星期天（2）Vmax和k3（kcat)的意义一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。[S]很大时，Vmax＝k3[E]。k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，——又称为转换数、催化常数kcatkcat越大，酶的催化效率越高第24页,共115页，2024年2月25日，星期天（3）kcat/km的意义：V=Vmax[S]Km+[S]∵Vmax=kcat[Et]∴V=kcat[Et][S]Km+[S]当[S]<<Km时，[E]＝[Et]第25页,共115页，2024年2月25日，星期天是E和S反应形成产物的表观二级速率常数。其大小可用于比较酶的催化效率。kcat/km＝

kcat/km的上限为k1,即生成ES的速率，即酶的催化效率不超过E和S形成ES的结合速率kcat/km的大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。第26页,共115页，2024年2月25日，星期天（1）Lineweaver-Burk林-贝氏双倒数作图法3、Km与V的求取第27页,共115页，2024年2月25日，星期天第28页,共115页，2024年2月25日，星期天蔗糖酶米氏常数（Km）的测定1.配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保温；2.加入3U/ml已在35℃水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应；3.各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值；4.作图第29页,共115页，2024年2月25日，星期天（2）Eadie-Hofstee作图法第30页,共115页，2024年2月25日，星期天vV[S]Vmax斜率－Km第31页,共115页，2024年2月25日，星期天

（3）Hanes-Woolf作图法

第32页,共115页，2024年2月25日，星期天斜率=1/VmKm/Vm-Km[S]/V[S]第33页,共115页，2024年2月25日，星期天vVmax[S]－3Km－2Km－Km（4）Eisenthal和Cornish-Bowden线性作图法第34页,共115页，2024年2月25日，星期天二、多底物的酶促反应动力学

分为单底物、双底物和三底物反应1.酶促反应按底物分子数分类：第35页,共115页，2024年2月25日，星期天①有序反应（orderedreactions）领先底物释放释放A和Q竞争地与自由酶结合（1）序列反应或单－置换反应2.多底物反应按动力学机制分类：第36页,共115页，2024年2月25日，星期天②随机反应（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应第37页,共115页，2024年2月25日，星期天AAEPE’PEE’QEQEBB

A和Q竞争自由酶E形式

B和P竞争修饰酶形式E’A和Q不同E’结合

B和P也不与E结合。(2)乒乓反应或双－置换反应第38页,共115页，2024年2月25日，星期天3.双底物反应的动力学方程（1）序列机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A与酶结合的解离常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率第39页,共115页，2024年2月25日，星期天第40页,共115页，2024年2月25日，星期天（2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率第41页,共115页，2024年2月25日，星期天第42页,共115页，2024年2月25日，星期天

三、酶的抑制作用失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。抑制剂：能引起抑制作用的物质。第43页,共115页，2024年2月25日，星期天（一）抑制程度的表示方法V0：Vi：不加入抑制剂时的反应速率加入抑制剂后的反应速率以反应速率的变化表示第44页,共115页，2024年2月25日，星期天1.相对活力分数（残余活力分数）2.相对活力百分数（残余活力百分数）V0ViViV0第45页,共115页，2024年2月25日，星期天3.抑制分数——指被抑制而失去活力的分数V0Vi4.抑制百分数ViV0

抑制率第46页,共115页，2024年2月25日，星期天

依据：

能否用透析、超滤等物理方法

除去抑制剂，使酶复活。不可逆抑制与可逆抑制（二）抑制作用的分类第47页,共115页，2024年2月25日，星期天1、不可逆抑制作用：抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连很多为剧毒物质重金属、有机磷、有机汞、有机砷、氰化物、青霉素、毒鼠强等。不可逆抑制第48页,共115页，2024年2月25日，星期天不可逆抑制剂

非专一性不可逆抑制剂（作用于一/几类基团）

专一性不可逆抑制剂（作用于某一种酶的活性部位基团）2、不可逆抑制剂不可逆抑制第49页,共115页，2024年2月25日，星期天

（1）非专一性不可逆抑制剂①重金属离子

Ag+、

Cu2+、

Hg2+、

Pb2+、

Fe3+

高浓度时可使酶蛋白变性失活；低浓度时对酶活性产生抑制。

——通过加入EDTA解除第50页,共115页，2024年2月25日，星期天

H2N-CH-COOH

CH2

SH

H2N-CH-COOH

CH2

S-CH2COOHICH2COOHHI②烷化剂（多为卤素化合物）++碘乙酸第51页,共115页，2024年2月25日，星期天③有机磷化合物（敌百虫、沙林）第52页,共115页，2024年2月25日，星期天胆碱酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药部分第53页,共115页，2024年2月25日，星期天胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱乙酰胆碱积累导致神经中毒症状第54页,共115页，2024年2月25日，星期天如何紧急救治？排毒洗胃、喝鸡蛋清牛奶导泄、利尿血液透析（清除游离状态毒物）解毒药：解磷定第55页,共115页，2024年2月25日，星期天ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有机磷化合物羟基酶磷酰化酶(失活)酸ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P解磷定解毒------解磷定(PAM)：第56页,共115页，2024年2月25日，星期天④有机汞、有机砷化合物——与酶分子中-SH作用；

可通过加入过量巯基化合物解除。第57页,共115页，2024年2月25日，星期天⑤氰化物、硫化物和CO

——与酶中金属离子形成稳定的络合物如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合⑥青霉素（penicillin）与细菌糖肽转肽酶Ser-OH活性，影响细胞壁合成。第58页,共115页，2024年2月25日，星期天（2）专一性不可逆抑制剂

①Ks型具有底物类似的结构——（设计）带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制）

∵利用对酶亲合性进行修饰∴亲合标记试剂（affinitylabelingreagent）第59页,共115页，2024年2月25日，星期天②Kcat型具有底物类似的结构本身是酶的底物还有一潜伏的反应基团“自杀性底物”

第60页,共115页，2024年2月25日，星期天

抑制作用可通过透析等方法除去。原因：非共价键结合可逆抑制竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveI.）反竞争性抑制(uncompetitiveI.)

3、可逆抑制作用：第61页,共115页，2024年2月25日，星期天（1）竞争性（Competitive)抑制第62页,共115页，2024年2月25日，星期天I：抑制剂（inhibitor）第63页,共115页，2024年2月25日，星期天第64页,共115页，2024年2月25日，星期天【举例】

丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸琥珀酸第65页,共115页，2024年2月25日，星期天竞争性抑制第66页,共115页，2024年2月25日，星期天

磺胺类药物的抑菌机制：与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶＋对氨基苯甲酸＋谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸第67页,共115页，2024年2月25日，星期天利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药抗菌机理：（与对氨基苯甲酸是结构类似物）竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。第68页,共115页，2024年2月25日，星期天生物碱麻醉—竞争性替代生物碱—吗啡、海洛因、可卡因、尼古丁

吗啡海洛因第69页,共115页，2024年2月25日，星期天麻醉机理源自—37C医学网痛觉神经信号阿片—鸦片类物质生物碱竞争性替代脑肽—麻醉致幻脑肽(E)控制痛觉信号的释放第70页,共115页，2024年2月25日，星期天抑制物（2）非竞争性（Non-competitive)抑制无法形成产物第71页,共115页，2024年2月25日，星期天Noncompetitiveinhibition第72页,共115页，2024年2月25日，星期天第73页,共115页，2024年2月25日，星期天（3）反竞争性（Uncompetitive）抑制第74页,共115页，2024年2月25日，星期天第75页,共115页，2024年2月25日，星期天第76页,共115页，2024年2月25日，星期天1：反应体系不加I2：体系中加入一定量不可逆抑制剂3：体系中加入一定量可逆抑制剂v123[E](三)可逆和不可逆抑制作用的鉴别第77页,共115页，2024年2月25日，星期天[E]v不可逆抑制剂的作用[E]v可逆抑制剂的作用[I]→[I]第78页,共115页，2024年2月25日，星期天(四）可逆抑制作用动力学第79页,共115页，2024年2月25日，星期天1.竞争性抑制第80页,共115页，2024年2月25日，星期天消去[ES]第81页,共115页，2024年2月25日，星期天第82页,共115页，2024年2月25日，星期天第83页,共115页，2024年2月25日，星期天斜率斜率第84页,共115页，2024年2月25日，星期天竞争性：I与S与酶活性中心结合机会均等

V下降发生抑制Km增大亲和力Vmax不变[S]增大，I结合机率减小第85页,共115页，2024年2月25日，星期天Km变大，Vmax不变第86页,共115页，2024年2月25日，星期天2.非竞争性抑制第87页,共115页，2024年2月25日，星期天第88页,共115页，2024年2月25日，星期天截距第89页,共115页，2024年2月25日，星期天V下降发生抑制Km不变亲和力不受影响Vmax减小部分酶始终失活第90页,共115页，2024年2月25日，星期天Km不变，Vmax变小

第91页,共115页，2024年2月25日，星期天3.反竞争性抑制作用第92页,共115页，2024年2月25日，星期天第93页,共115页，2024年2月25日，星期天第94页,共115页，2024年2月25日，星期天Km、Vmax都变小第95页,共115页，2024年2月25日，星期天第96页,共115页，2024年2月25日，星期天四、影响酶催化反应速率的因素底物浓度酶浓度抑制剂第97页,共115页，2024年2月25日，星期天上图反映出温度如何影响酶活力？产物累积量相对酶活％

最适温度

最适温度动物酶

35~40℃植物酶40~50℃微生物大部分

40~50℃个别高温菌90℃以上（一）温度对酶反应的影响第98页,共115页，2024年2月25日，星期天温度越高，活化分子越多，反应速度快；酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。钟罩型曲线第99页,共115页，2024年2月25日，星期天

（二）pH对酶反应的影响最适pH时的酶活力最大最适pH因酶而异，多数酶在7.0左右是酶的特性之一唾液淀粉酶精氨酸酶胃蛋白酶第100页,共115页，2024年2月25日，星期天pH对酶活的影响：

pH的改变破坏酶的空间构象，引起酶活性的丧失（可逆不可逆）；pH的改变影响酶活性中心催化基团的解离，从而使得底物转变成产物的过程受到影响；pH的改变影响酶活性中心结合基团的解离状态，使得底物不能与其结合；pH的改变影响底物的解离状态，或者使底物不能与酶结合，或者结合后不能生成产物。第101页,共115页，2024年2月25日，星期天

（三）激活剂对酶反应的影响第102页,共115页，2024年2月25日，星期天①无机离子阳离子

K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+等阴离子

Cl-、Br-等②中等大小的有机分子③某些激酶第103页,共115页，2024年2月25日，星期天产物抑制：在酶反应中，产物在释出之前可以和酶以复合物(EP)的形式存在，也即产物可以占领酶分子上的特殊位点，从而导致酶的催化速度下降。

（四）产物对酶反应的影响第104页,共115页，2024年2月25日，星期天根据其化学组成可将酶分为：

简单蛋白酶：只需要其蛋白质部分就具有催化功能的酶。复合蛋白酶：需要有非蛋白成分协助的酶，也称“结合蛋白质酶”复合蛋白酶的非蛋白成分称为辅因子或辅基，金属酶需要Mg2+、Fe2+、Zn2+等金属作辅基。（五）辅酶的影响其它一些酶则需要小分子有机化合物如B族维生素作为辅因子，称为辅酶。第105页,共115页，2024年2月25日，星期天辅酶是某些酶的必需组成部分。没有它，酶不表现活性；加入它，在达到酶蛋白和辅酶物质确定的比例以前，活性随加入的辅酶物质的量而成比例的升高。辅酶物质包括三种类型：二是辅酶，它与酶蛋白结合较松，可看成是双底物反应中的底物之一，也可看成是活化剂。一是载体底物，实际上可看作是某些双底物酶反应中的一种底物。三是辅基(protheticgroup)，一般与酶蛋白结合紧密，但对脱去辅基的酶蛋白来说，它起着类似活化剂的作用。第106页,共115页，2024年2月25日，星期天

理解微生物代谢活动(途径及其控制)的意义以便提出实用的生化问题，并弄清楚环境中哪些因素有可能影响产品产量，而必须严加控制是很重要的。

微生物经过长期的自然选择，具备了一套完美的代谢调节机制，平衡各代谢途径基质的流通量和反应速率，以适应外界环境的变化。在细胞内，除细胞膜水平的底物渗透性外，有酶活性的调节和酶量(合成)的调节两种不同的酶调节机制。五、微生物代谢调节的生化基础第107页,共115页，2024年2月25日，星期天一、酶活性的调节

微生物代谢调节的主要方式是通过小分子化合物调节酶促反应的速度。这些小分子化合物一般存在于细胞内，是由细胞自己产生的。通过它们对代谢途径中关键酶活性的抑制和激活作用，有效地控制每种基本代谢过程。细胞中蛋白质(酶)生物活性的调节可以归纳为以下5种方式：共价修饰、缔合与解离、竞争性抑制、变构(或副位)效应和基因表达。基因表达是一种调节酶量合成，使酶活性发生变动的代谢调节作用(酶的诱导和阻遏)，第108页,共115页，2024年2月25日，星期天（一）共价修饰作用

蛋白质凭借其分子中一个或多个氨基酸残基与一种化学基团进行共价连接或拆开，而使其活性发生改变。这种基团通常是磷酸根，共价结合部位为丝氨酸残基的-CH2OH。1、可逆共价修饰作用细胞中有些酶以活性形式和非活性形式存在，而且两种形式可以通过另外的酶的催化作用进行共价修饰而互相转换。酶的可逆性共价修饰作用有两重意义：

(1)可在短时间内生成大量活性改变了的酶，有效地控制细胞的代谢状况；

(2)可逆修饰更易做到为响应代谢环境的变化而控制酶的活性。这一系统具有能随机应变的特点，因而处在不断活化和钝化状态。第109页,共115页，2024年2月25日，星期天2、不可逆共价调节

无活性的酶原当功能需要时，被相应的蛋白酶作用切去一小段肽链而活化，故又称为酶原激活。酶原变为酶是不可逆的，一旦这些生成的蛋白酶完成了它们的使命以后，便被降解而不再恢复为酶原。这种酶活性的关闭作用是极其重要的，胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶的过程就是这种共价结构