药物残留溶剂分析方法的建立与应用

药物残留溶剂分析方法的建立与应用内容提要药物残留溶剂分析与控制顶空气相色谱法及其在残留溶剂测定中的应用现状影响药物残留溶剂的有关因素溶剂化参数模型与色谱柱的选择如何建立药品质量标准残留溶剂检测方法气相色谱法常见的问题与解决方案第2页,共74页，2024年2月25日，星期天药物残留溶剂分析与控制各国药典中残留溶剂控制标准的沿革USP、BP、EP、JP、ChP.现行标准的比较残留溶剂分析方法残留溶剂分析方法的进展第3页,共74页，2024年2月25日，星期天各国药典中残留溶剂控制标准的沿革Usp第22版第三补充本（1990）开始收载<467>有机挥发性杂质的检查，Usp第23版(1995)正式列入附录中，规定了氯仿、苯、1，4-二氧六环、二氯甲烷、环氧乙烷和三氯乙烯6种有机溶剂的控制要求，采用3种气相色谱法。BP于1993年版增补本（1996）首次增加残留溶剂检查项，规定了乙腈、氯仿、苯、1，4-二氧六环、二氯甲烷、吡啶和三氯乙烯7种有机溶剂的控制要求，检测方法为静态顶空毛细管柱气相色谱，FID为检测器，采用系统A和系统B两个系统进行测定。EP从第三版（1997）开始收载2.4.24残留溶剂检查法，其控制对象和检测方法同BP(1993)增补本。ChP1995版在附录中收载有机溶剂残留量测定法，控制氯仿、苯、1，4-二氧六环、二氯甲烷、吡啶、三氯乙烯、甲苯和环氧乙烷等8种有机溶剂，采用填充柱气相色谱法，直接进样和顶空进样两种方式。第4页,共74页，2024年2月25日，星期天ICH制定的溶剂残留指导原则药品中的残留溶剂-----在原料药、辅料以及制剂生产中使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机挥发性化合物。药品中残留溶剂的种类：69种分类：按照对人体和环境的危害程度分为4类第5页,共74页，2024年2月25日，星期天第一类溶剂应避免使用的溶剂，为人体致癌物、疑似的人体致癌物或能对环境造成公害的试剂第二类溶剂应限制使用溶剂，为能导致动物非遗传毒性致癌或可能导致其他不可逆毒性反应的试剂第三类溶剂低毒性溶剂，为在药物中以一般量存在时对人体无害的溶剂。残留量一般不高于0.5%第四类溶剂没有足够毒性资料的溶剂，生产厂在使用时应提供这些溶剂在制剂中残留水平的合理性论证报告第6页,共74页，2024年2月25日，星期天第一类溶剂溶剂名称浓度限度（ppm）苯2四氯化碳41，2－二氯乙烷51，1-二氯乙烯81，1，1－三氯乙烷1500第二类溶剂溶剂名称浓度限度（ppm）乙腈410氯苯360氯仿60环己烷38801，2－二氯乙烯1870二氯甲烷6001，2－二甲氧基乙烷100N,N-二甲基乙酰胺1090N,N-二甲基甲酰胺8801，4－二氧六环3802－乙氧基乙醇160乙二醇62甲酰胺220正己烷290甲醇30002－甲氧基乙醇50甲基丁基酮50甲基环己烷1180N-甲基吡咯烷酮530硝基甲烷50吡啶200四氢噻砜160四氢化萘100甲苯8901，1，2－三氯乙烯80二甲苯﹡2170四氢呋喃720第三类溶剂

5000ppm溶剂名称溶剂名称乙酸正庚烷丙酮乙酸异丁酯甲氧基苯乙酸异丙酯正丁醇乙酸甲酯仲丁醇3－甲基－1－丁醇乙酸丁酯丁酮叔丁基甲基醚甲基异丁基酮异丙基苯异丁醇二甲亚砜正戊烷乙醇正戊醇乙酸乙酯正丙醇乙醚异丙醇甲酸乙酯乙酸丙酯甲酸

第四类溶剂溶剂名称溶剂名称1，1－二乙氧基丙烷甲基异丙基酮1，1－二甲氧基甲烷甲基四氢呋喃2，2－二甲氧基丙烷石油醚异辛烷三氯乙酸异丙醚三氟乙酸第7页,共74页，2024年2月25日，星期天USP、BP、EP、JP、ChP.现行标准的比较Usp32中的<467>收载残留溶剂，讲述残留溶剂的分类、限度的描述、分析过程、限度以及分析控制方法，分析方法上，将残留溶剂一类和二类分成一组，三类单独一组。其中一类和二类又分成水溶性的、水不溶性的和高沸点的三种，采用三种不同的分析方法；三类溶剂则采用干燥失重法。其他基本上同ICH的基本要求。BP中的残留溶剂基本上同EP，分析方法采用两种不同的分析体系，即分析一类溶剂采用方法A，二类采用方法B（方法A、B均为顶空进样，程序升温，毛细管柱，FID)，供试品也分成三种类型：水溶性的、水不溶性的和高沸点的三种，其他基本上同ICH的基本要求。JP与ICH一致。ChP.（2010）与ChP.（2005）相比较，在沿用ChP.（2005）的基础上作了如下几处修订：第8页,共74页，2024年2月25日，星期天1.对照品溶液的制备精密称取各品种项下规定检查的有机溶剂适量，采用与制备供试品溶液相同的方法和溶剂制备对照品溶液；如用水作溶剂，应先将待测有机溶剂溶解在50%DMSO或DMF溶液中，再用水逐步稀释。2.顶空平衡温度一般应低于溶解供试品所用溶剂的沸点10℃以下，能满足检测灵敏度即可；对于沸点过高的溶剂，如甲酰胺、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等，用顶空进样测定的灵敏度不如直接进样，一般不宜用顶空进样方式测定。3.利用保留值定性是气相色谱中常用的定性方法。色谱系统中载气的流速、载气的温度和柱温等的变化都会使保留值改变，从而影响定性结果。校正相对保留时间（RART）只受柱温和固定相性质的影响，以此作为定性分析参数较可靠。应用中通常选用甲烷测定色谱系统的死体积（t0):

第9页,共74页，2024年2月25日，星期天干燥失重法、热重测定法紫外、红外光谱法残留溶剂测定方法

非专属性多种溶剂混合只能得到所有残留溶剂的总量水分也会干扰测定检测灵敏度低,干扰因素多专属性良好的分离能力高灵敏度核磁共振光谱法检测灵敏度低气相色谱法ICH及各国药典推荐使用的方法残留溶剂分析方法第10页,共74页，2024年2月25日，星期天动态顶空进样方式直接进样顶空进样色谱柱填充柱毛细管柱检测器FIDECD固相微萃取气相色谱静态顶空第11页,共74页，2024年2月25日，星期天三种气相色谱法的优缺点比较直接进样气相色谱法优点：方法比较简单、可靠，仅需要是自动进样器，不需要其他装置缺点：样品本身及样品中含有的不挥发性组分也会被注入到气相色谱中，污染进样口、色谱柱，缩短色谱柱使用寿命；样品基质同时被注入到气相色谱中，在下一次进样前必须使用较高的柱温把这些物质从色谱柱中赶出来，延长了整个分析过程的时间顶空（静态顶空）优点：简便、干净、快速、不需要使用大量的有机溶剂且易于实现仪器自动化，药品本身不进入气相色谱，只有易挥发性的残留溶剂等杂质进入气相色谱进行分析缺点：灵敏度稍低，受多种因素影响（溶剂体系、基质效应等）第12页,共74页，2024年2月25日，星期天顶空（动态顶空）用流动的气体将样品中的挥发性成分“吹扫”出来，再用一个捕集器吸附吹扫出来的物质，然后经热解析将样品送入气相色谱仪进行分析优点：灵敏度高，比静态顶空至少高1000倍，分析过程中不需要等待气体与样品基质之间的平衡缺点：样品管较难清洗，重现性比静态顶空低，仪器复杂，不便于推广固相微萃取技术灵敏度高，已经逐渐成为药物中残留溶剂分析的新选择第13页,共74页，2024年2月25日，星期天残留溶剂分析方法的新进展快速分离

Chen等用一根10mx0.1mmx0.4um的DB-624毛细管色谱柱，快速分离38中常用有机溶剂，分析时间不到4.9min。而用30mx0.32mmx1.8um的DB-624分析时间将达45min.Wittrig和Dorman等采用流量调节技术在一次色谱分析中实现36种残留溶剂的分离，分析时间12min。

David等采用过低热质量（LTM)柱温箱来实现快速分离。快速定性

Hu等利用双通道并联色谱系统：即利用两根极性相反的SPB-1和HP-FFAP色谱柱，分别考察51种有机溶剂在等温和程序升温条件下的出峰顺序，计算各有机溶剂相对参比溶剂丁酮的相对保留时间，以相对保留时间作为定性参数建立知识库。进样方法

Brault等介绍的全挥发技术。第14页,共74页，2024年2月25日，星期天顶空气相色谱法及其在残留溶剂测定中的应用现状顶空气相色谱法(headspacegaschromatography,HS-GC)是用气体对液体或固体样品中挥发性组分进行萃取的一种预处理方法。将含有挥发性组分的样品置于密闭系统中，在一定温度下使样品中挥发性组分在气-液或气-固两相甚至气-液-固三相中的分配达到平衡，然后取凝聚相上端的气体送入气相色谱仪进行分析，即可间接测定样品中的挥发性组分目前药品管理部门和各国药典推荐使用的检测药品中残留溶剂的最适合技术为静态顶空气相色谱法第15页,共74页，2024年2月25日，星期天顶空气相色谱法的基本原理V=VG+VS相比：β=VG/VS

在恒定温度下，密闭系统中的气液两相达到平衡时，气相中某挥发性组分的浓度为cG，其在液相中的浓度为cS，其原始浓度为c0，则分配系数K=cS/cG容器是密闭的，样品不会逸出，则c0Vs=cGVG+cSVS=cGVG+KcGVS=cG(VG+KVS)c0=cG(VG/VS+K)=cG(K+β)cG＝c0/(K+β)第16页,共74页，2024年2月25日，星期天

化合物的蒸汽压pi0受其温度影响,两者为指数关系，可表示为以下公式：

而化合物的蒸汽压与分配系数存在反比的关系：

所以化合物的分配系数与温度存在如下关系：

第17页,共74页，2024年2月25日，星期天顶空气相色谱法灵敏度的影响因素顶空灵敏度样品溶液体积顶空平衡温度盐析效应溶剂体系

A∝cG＝c0/(K+β)物质专属性第18页,共74页，2024年2月25日，星期天

温度与相比的影响

cG＝c0/(K+β)顶空灵敏度是受K和β共同影响的K远大于β,K+βK

顶空灵敏度只与K值有关：温度越高，顶空灵敏度越高。在这种情况下，相比(样品体积)实际上是没有影响的，或者影响很小。由于K值对温度变化很敏感，所以顶空温度对灵敏度的影响很大

K小于β,K+ββ

顶空灵敏度由相比决定，分配系数没有影响或是几乎没有影响。相比与温度无关，所以顶空温度对灵敏度几乎没有影响第19页,共74页，2024年2月25日，星期天示例：K40℃50℃60℃70℃80℃1乙醇13558205113282162丁酮139.510968.847.7353甲苯2.822.231.771.491.274正己烷0.140.0680.0430.0120.00755四氯乙烯1.481.281.270.780.87第20页,共74页，2024年2月25日，星期天样品体积的改变对低分配系数的样品影响较大，对于较高分配系数时的分析结果的影响是可以忽略的灵敏度样品体积占顶空体积的百分比20%80%K=0.2110倍K=1.014倍K=2011.2倍K=25011.01倍溶液的体积第21页,共74页，2024年2月25日，星期天化合物的活性系数在一定条件下是可以改变的对于极性化合物的溶液，可以通过向样品中加入较高浓度的无机盐，从而增加化合物的活性系数，降低了分配系数，以提高顶空灵敏度，这种技术通常被称为盐析效应

盐析对被分析物的作用是不同的，对于有活性氢的极性化合物的作用要强于非极性化合物加入的大量无机盐同时也增加了液体样品的体积，降低了相比β，从而提高了灵敏度盐析效应的影响第22页,共74页，2024年2月25日，星期天盐析效应的局限

盐析效应仅对极性化合物起作用在高浓度时才有作用（对于ppb级的卤代烃的溶液，无机盐浓度低于5％对于色谱峰面积几乎都没有什么影响）我们不可能预测盐析效应对不同分析物的影响以及不同分析物的线性范围。所以这个技术在使用时要谨慎，在用作定量分析之前对其作用要进行考察第23页,共74页，2024年2月25日，星期天很多有机化合物在有机溶剂中的溶解度要大于在水中的溶解度，它们的分配系数在有机溶剂中比较大，如果在能与水混溶的有机溶剂作为溶剂的溶液中加入水，那么化合物的溶解度降低，分配系数随之降低，顶空灵敏度就会增加在使用这个方法时要保证被分析物仍然是可以溶解在这个溶剂—水体系中的溶剂体系第24页,共74页，2024年2月25日，星期天

首先应用于分析聚合物中残留的2-乙基己基丙烯酸脂（EHA）二甲基乙酰胺为溶剂2ml水5ml灵敏度增加600倍示例第25页,共74页，2024年2月25日，星期天1.共出峰干扰

示例：吡柔比星中正己烷残留量的测定色谱柱方法正己烷含量DB-624内标法(正戊烷）5%SPB-1内标法（正丙醇）0.6%当有机溶剂残留量超出限度规定时，通常需要对该样品进行共出峰干扰的考察影响药物残留溶剂的有关因素第26页,共74页，2024年2月25日，星期天共出峰的干扰在同一色谱条件下具有相同保留值的不同物质－共出峰物质解决的办法－两个不同的物质在性能不同的两支或多支色谱柱上具有完全相同保留值的概率很小，因此用两支不同性能的色谱柱可以排除共出峰干扰

规则1：对残留溶剂测定不符合规定的样品，采用极性不同的色谱系统进行验证，可有效地排除共出峰的干扰。第27页,共74页，2024年2月25日，星期天2.热降解干扰在顶空平衡的过程中，对于热不稳定的样品会发生热降解，如果降解产物恰好是某种有机溶剂，将导致把降解产物当作目标残留溶剂的错误测定结果顶空气相色谱法测定药品残留溶剂时必须注意药品的热稳定性第28页,共74页，2024年2月25日，星期天示例：含有甲氧基结构药品中甲醇残留量的测定头孢西丁钠、头孢美唑、氟氧头孢、利福平取上述药品约0.2g，置20mL顶空瓶，加水2.0mL溶解，顶空温度分别为70℃和120℃，平衡时间30min顶空温度甲醇的峰面积头孢西丁头孢美唑氟氧头孢利福平70℃21.7815.526.122.7120℃1100.451309.42667.4965.2

含甲氧基的药品用顶空气相色谱法测定残留溶剂时不宜使用100℃以上的顶空温度，使用70℃的顶空温度比较合适第29页,共74页，2024年2月25日，星期天示例：头孢泊肟酯的热降解反应峰号溶剂峰保留时间(min)溶剂峰面积80℃顶空100℃顶空120℃顶空15.5（甲醇）230.6566.31256.026.7338.2317.3298.639.03039.82943.32917.549.7（异丙醇）84.5288.0928.4510.98852.48947.19026.9612.06539.26774.96931.3NSHHOCH2OCH3COOCHOCCH3OCH(CH3)2CONHCNOCH3SNH2NO第30页,共74页，2024年2月25日，星期天根据分子热裂解规律并结合GC-MS、GC-IR的确证分析，确证样品分子在较高顶空温度下确实可以发生热裂解产生甲醇和异丙醇顶空温度峰面积含量

甲醇异丙醇甲醇异丙醇80℃222.275.60.16%0.03%60℃198.362.70.16%0.04%规则2：分子结构中有烷氧基的药品顶空过程中可能热降解产生相应的醇规则3：为防止烷氧基在顶空过程中的热降解，顶空温度通常不应超过70℃第31页,共74页，2024年2月25日，星期天考察药品是否在顶空条件下发生热降解方法：分别用较低和较高的顶空温度分析样品，比较色谱图及测定结果。如果较高顶空温度下有机溶剂的检出量明显增高，所得色谱峰数目增多，则表明药品在较高顶空温度下发生热降解，应使用较低的顶空温度测定该药品中残留溶剂当需要确定某药品未在顶空条件下降解产生干扰某种残留溶剂测定的物质时，可以用已知不含有该残留溶剂的同种药品作为对照药品，在相同的条件下测定。如果在所用的顶空条件下对照药品未检出该种残留溶剂，则表明药品在此顶空条件下不会产生干扰该种残留溶剂测定的物质规则4：改变顶空温度可以判断顶空条件下样品是否可能产生热降解干扰。规则5：利用不含残留溶解的对照样品，可以确证样品在顶空条件下是否会产生热降解干扰物。第32页,共74页，2024年2月25日，星期天3.基质效应的影响基质效应—顶空分析时，由于对照品溶液和供试品溶液的组成不同，使待测挥发性组分在气液两相间的分配系数不同而引起的定量误差减小基质效应影响的方法—标准加入法

规则6：定量方式的选择—药物中残留溶剂的测定通常属于微量或痕量分析，定量时通常不采用外标法，而采用定量精度更高的内标法或标准加入法。规则7：当内标法与标准法结果偏差约10％时，可以认为方法存在明显的基质效应，应以标准加入法的结果为准第33页,共74页，2024年2月25日，星期天4.药品溶解性及溶剂介质的影响1、溶剂介质选择的一般原则：水

经济、无毒、对FID无响应1无机酸或碱溶液

注意：含有酯类结构的或分析酯类溶剂不宜采用酸或碱溶液2有机溶剂

应选择高沸点的有机溶剂3当药物只能溶于有机溶剂时应选择高沸点的有机溶剂，如DMF,DMA或DMSO，当药品中待测残留溶剂是DMF或DMA时，则需要用一种特殊的溶剂----1,3二甲基-2-咪唑啉酮（DMI)来溶解药品。规则8：溶解介质不应导致供试品或待测残留溶剂在顶空条件下迅速发生化学反应，并影响测定结果的正确性。规则9：对含有酯类结构的药物或分析酯类溶剂时，通常不宜采用酸或碱溶液为溶解介质。第34页,共74页，2024年2月25日，星期天2、药品溶解性对其中残留溶剂测定的影响药品溶剂介质药品的溶解性残留溶剂残留量(％）RSD(%)头孢氨苄水不溶甲醇0.3854.40.5mol/LNaOH溶甲醇0.4271.9头孢泊肟酯水不溶丙酮0.001673.0DMF溶丙酮0.00354.1水不溶乙酸乙酯0.02220.3DMF溶乙酸乙酯0.0432.6

选择合适的溶剂介质溶解药品对残留量测定结果有重要影响，应选择能使药品完全溶解的溶剂，否则测定结果将偏低，且测定精密度变差第35页,共74页，2024年2月25日，星期天待测溶剂的溶解性对测定的影响

药品中残留溶剂的溶解性通常不是影响其残留量测定结果的主要因素，但不正确的对照品溶液制备方法可能导致实验误差。对不能与溶剂溶介质互溶的有机溶剂，采用助溶剂帮助其迅速在溶解介质中分散是正确的对照品溶液制备方法。第36页,共74页，2024年2月25日，星期天

溶剂介质对测定结果的影响

在选择溶解药品的溶剂时，并不是所有能使药品溶解的溶剂都适于用作顶空测定时的溶剂。评价所用的溶剂介质是否适用于测定该药品的残留溶剂，应该用回收率实验考察方法的准确性。当回收率在可接受范围时（80%~120%），表明方法的准确性较好，此时标准加入法可以获得比内标法更准确的测定结果。如果方法的回收率太差，则标准加入法也不可能得到准确结果。（标准加入法能够消除基质效应的前提是向样品中加入待测组分的对照品，不会显著改变各相间的热力学性质，即加入对照品前后待测组分的分配系数K几乎恒定）。如果相同浓度的内标在对照品溶液和供试品溶液中的峰面积变化超出了实验操作误差所可能引起的改变，则说明在此溶液中药物分子间及与有机溶剂分子间可能存在某种结合与解离，不宜用这种溶剂介质溶解药品测定其中的残留溶剂。

第37页,共74页，2024年2月25日，星期天规则9：当回收率在可接受范围时（80%~120%），用标准加入法可以获得比内标法更准确的测定结果；反之，如果方法的回收率太差，则标准加入法也不可能得到准确结果。规则10：方法建立后应该用回收率实验考察方法的准确性，当方法的回收率超出80%~120%时，提示溶解介质不宜作为该药品残留溶剂测定的溶剂，应改换其他介质重新实验。

第38页,共74页，2024年2月25日，星期天溶剂化参数模型与色谱柱的选择

溶剂化参数模型是描述中性分子在色谱系统中达到平衡分离时，分子间相互作用对保留值的影响的有力工具。这一过程的自由能被分为以下几部分：形成空穴、建立分子间的相互作用（包括色散力、孤对电子、偶极类型和氢键）。这些相互作用力的贡献可以用固定相的一系列系统常数来表示。溶剂化参数模型将溶质从气相溶解到固定相的过程分为3个阶段：

1.在固定相中形成一定大小的空穴

2.孔穴周围的溶剂分子的重新排列

3.溶剂进入孔穴

溶剂化参数模型介绍

第39页,共74页，2024年2月25日，星期天溶质在固定相上的保留值可用Abraham公式表示

SP是与自由能相关的溶质特性，如分配系数、保留因子、相对调整保留时间（RART)或者相对保留指数值；R2、、、、是描述溶质性能的参数，R2是溶质修正的摩尔折光指数，是溶质的偶极，是溶质的酸性氢键（给质子性），是溶质的键性氢键（受质子性），是25℃时溶质在正十六烷烃上的保留值。而式中的c、r、s、a、b、l是表征色谱柱固定相保留能力的常数，每种固定相有特定值。c为常数，r为溶剂与n-电子对及π–电子对作用的常数，s表示溶剂参与静电和诱导作用能力的常数，a表示溶剂参与键性氢键作用的常数，b为溶剂参与酸性氢键作用的常数，l则是溶剂空穴形成和溶剂-溶剂间色散力大小的常数，从色谱角度他表示分离同系物能力的大小。第40页,共74页，2024年2月25日，星期天有机溶剂与不同固定相的相互作用关系

1.有机溶剂性能参数分类

根据溶剂化参数模型，以有机溶剂的5个性能参数为指标，利用主成分分析法对有机溶剂进行分类：第一组：醇类第二组：烷烃、酯和酮类第三组：含氯化合物不同固定相的溶剂化参数模型有机溶剂的RART与其性能参数的关系第41页,共74页，2024年2月25日，星期天第一组醇类化合物的值明显高于第二组和第三组化合物，激情间可作为醇类于其他化合物的主要依据；第三组含氯化合物的R2值明显高于第一组和第二组化合物，可作为分离含氯化合物于其他化合物的主要依据。三组有机溶剂性能参数的比较第42页,共74页，2024年2月25日，星期天2.不同固定相系统常数的比较从溶剂化参数模型中不同色谱柱的系统常数表可见，HP-5和HP-35色谱柱（固定相为二甲聚硅氧烷中加入二苯基），随着固定相中二苯基比例的增加，r、s和a之逐渐增大，l值则基本不变。DB-624和AT-225柱（固定相为二甲聚硅氧烷中加入氰基丙基苯基）的选择型与HP-5和HP-35不同，DB-624与HP-5相比，r、s值高于HP-5；AT-225柱中氰基丙基苯基的比例增加到50%时，r、s值明显增大，l值则降低。ZB-WAX柱的固定相为100%聚乙二醇，r、s和和a是影响溶质于其相互作用的主要因素，l值则降低SPB-1色谱柱。

第43页,共74页，2024年2月25日，星期天3.固定相系统常数与有机溶剂的分离第一组醇类化合物与其他化合物的分离可以通过增加值来达到分离，因此可以选择a值较大的色谱柱,如100%聚乙二醇为固定相的色谱柱；对于组内不同的醇类化合物，其差别主要体现在上，可以通过改变了值达到分离，因此选择l值较大的色谱柱较为有利。第三组含氯化合物与其他化合物的分离可以通过增加rR2值来达到分离，可以选择r值较大的极性色谱柱。第二组化合物主要包括烷烃、酯类和酮，影响烷烃、酯类和酮保留质的因素主要为，适合在非极性和中等极性的色谱柱上分离。第44页,共74页，2024年2月25日，星期天药品质量标准残留溶剂检测方法的建立一确定药品中所涉及的残留溶剂种类二建立检测方法三方法的验证第45页,共74页，2024年2月25日，星期天一确定药品中所涉及的残留溶剂种类1

根据“药品残留溶剂测定知识库”确定样品中实际存在的残留溶剂种类0.1g/mL非极性色谱系统SPB-1极性色谱系统HP-INNOWAX程序升温计算挥发性成分RART程序升温计算挥发性成分RART与知识库中数据比较比较确定残留种类确定残留种类两个色谱系统中均出现的有机溶剂即可初步判定为药品中可能存在的残留溶剂与知识库中数据第46页,共74页，2024年2月25日，星期天

2在等温色谱系统中进一步判断产品中可能使用过的其它溶剂及其它可能存在的干扰选择适当的等温色谱系统和色谱条件，将供试品中测得的色谱峰的保留时间与相应对照品的保留时间比较，并通过标准加入法进一步证明初筛结果的正确性。对一些一类溶剂或产品工艺中未提及的溶剂，可用气质或气红进一步确证在等温条件下，将样品浓度提高至0.5g/mL，进一步考察样品中可能存在的其它微量残留溶剂，以排除可能的干扰作用第47页,共74页，2024年2月25日，星期天3.结合企业提供的工艺信息确定药品质量标准中应控制的残留溶剂虽然样品实际测定中不一定能检测到工艺中提及的诸多有机溶剂，但药品质量标准中残留溶剂检查法应能检测到样品中可能存在的所有残留溶剂，故将生产工艺中ICH规定的应控制的溶剂及产品中实际存在的溶剂均应作为检测对象第48页,共74页，2024年2月25日，星期天二建立检测方法

初步测定方法的选择药品结构顶空条件溶剂所确定的检测对象色谱系统内标初步选择的测定方法

测定方法的考察与优化通过对照品溶液，内标进行考察能达到分离度要求不能达到分离度要求适合条件通过供试品溶液，内标进行考察不能达到分离度要求适合条件能达到分离度要求最佳测定方案

不干扰被测溶剂的测定，不应与溶剂具有较强的相互作用第49页,共74页，2024年2月25日，星期天三方法的验证准确性（回收率）---回收率可接受范围一般为80％～120％；当方法的回收率超出此范围时，提示溶质与溶解介质间存在较强的相互作用，该溶剂不宜作为检测该药品残留溶剂的溶剂，应改换其它介质重新实验重复性---主要是日间重复性，至少应提供3天以上的数据最低检测限和最低定量限线性---范围不必很宽，关键是要提供限度附近的线性数据第50页,共74页，2024年2月25日，星期天示例：建立药品质量标准中盐酸头孢他美酯残留溶剂检查方法的研究收集样品：7个企业，19批样品需建立一个包括7个企业样品的统一的残留溶剂测定方法第51页,共74页，2024年2月25日，星期天1、确定药品中所涉及的残留溶剂的种类初筛0.1g/mL非极性色谱系统SPB-1极性色谱系统HP-INNOWAX程序升温计算挥发性成分RART程序升温计算挥发性成分RART比较比较确定残留种类确定残留种类初筛结果：7个企业的盐酸头孢他美酯中均可能含有异丙醇与知识库中数据与知识库中数据第52页,共74页，2024年2月25日，星期天证明

以初筛结果作为检测对象（异丙醇）采用等温色谱系统：SPB-1，40℃

供试品中色谱峰的保留时间与异丙醇对照品的保留时间比较----与对照品保留时间一致标准加入法：

样品溶液对照品+样品溶液证明供试品中的色谱峰为异丙醇第53页,共74页，2024年2月25日，星期天确证

气相色谱-红外光谱联用测定结果1.待测溶剂2.异丙醇进一步确证此物质为异丙醇第54页,共74页，2024年2月25日，星期天在等温色谱系统中进一步判断产品中可能使用过的其它溶剂及其它可能存在的干扰在40℃等温条件下，将7个企业的样品浓度由0.1g/ml提高到0.5g/ml，进一步考察样品中可能存在的其它微量残留溶剂，结果发现3个企业的样品中可能残留有石油醚；经与石油醚对照品比较，确定TR在8～17min间的一组色谱峰确实为石油醚

1.异丙醇2.DMSO引入的杂质峰

石油醚对照品样品第55页,共74页，2024年2月25日，星期天

结合企业提供的工艺信息确定药品质量标准中应控制的残留溶剂生产厂申报生产工艺中用到的溶剂实际检测出的残留溶剂A甲苯、二氯甲烷异丙醇B甲苯、二氯甲烷异丙醇、石油醚C乙醇、丙酮异丙醇D乙酸乙酯异丙醇E二氯甲烷、乙醇、丙酮、乙酸乙酯异丙醇、石油醚F二氯甲烷异丙醇、石油醚G异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲醇异丙醇第56页,共74页，2024年2月25日，星期天2、建立盐酸头孢他美酯残留溶剂检测方法

根据“知识库”建立初步的测定方法色谱柱系统：SPB-1----可完全分离

HP-INNOWAX---保留值较小，分离效果不好溶解介质：盐酸头孢他美酯不溶于水，且酸碱性溶液会使酯键水解，故选择有机溶剂，DMF与待测残留溶剂甲苯保留值相近，所以选择DMSO作为溶剂内标：首先选用丁酮，但发现丁酮与供试品有较强的相互作用，不宜作为内标；而正丙醇在SPB-1色谱柱上与待测的诸溶剂能较好分离，且不与供试品发生相互作用，故作为内标。甲苯在色谱系统中的保留值与其它溶剂相差较大，故增加甲基异丁基酮作为测定甲苯的内标第57页,共74页，2024年2月25日，星期天

干扰因素的排除盐酸头孢他美酯的结构中有甲氧基，在较高的顶空温度下会热降解产生甲醇，故顶空温度一般不宜超过70℃分别在60℃，80℃，100℃的顶空条件下分析样品，比较测定结果。除甲醇外，顶空过程中未出现其它热降解产物的干扰为防止样品在顶空过程中热降解产生甲醇，确定顶空温度为60℃第58页,共74页，2024年2月25日，星期天

计算机辅助优化选择出最优的程序升温方法：柱温:40℃，保持15min；再以10℃/min的升温速率上升到120℃，保持3min

1.甲醇2.乙醇3.丙酮4.异丙醇5.二氯甲烷6.内标正丙醇7.乙酸乙酯8.内标甲基异丁基酮9.甲苯10.DMSO第59页,共74页，2024年2月25日，星期天3残留溶剂检测方法的验证线性最低检测限重复性回收率第60页,共74页，2024年2月25日，星期天4.总结

1.建立残留溶剂检测方法：建立药品质量标准残留溶剂检查方法不同于对样品中的残留溶剂进行检测。后者只要检测出样品中实际存在的残留溶剂即可，但前者应适用于对所用企业、不同时期的同品种产品的测定。因此，所有工艺中用到的有机溶剂，不管其是否在质量标准中被控制，应均不干扰测定。此外，排除各种可能的干扰作用，特别是热降解干扰是建立残留溶剂检测方法的关键。而准确性（回收率实验）和重复性则是残留溶剂检测方法验证实验的关键指标。第61页,共74页，2024年2月25日，星期天

2.由于企业在生产过程中可以不断改进其生产工艺，虽然在建立药品质量标准残留溶剂检查方法时已经尽可能地考虑了不同生产工艺的影响，但在实际检测中仍有可能检测到质量标准中未规定的残留溶剂，根据2010年版《中华人民共和国药典》的有关规定，如果检出的溶剂超出了2010年版《中华人民共和国药典》附录中规定的限度，该样品仍为不符合规定第62页,共7