第八版 生物化学与分子生物学-DNA的生物合成课件

生物化学与分子生物学第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成第十四章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成复制(replication)是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。复制亲代DNA子代DNA第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成本章主要内容：DNA复制的基本特征

DNA复制的酶学和拓扑学变化原核生物DNA复制过程真核生物DNA生物合成过程逆转录和其他复制方式第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成DNA复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一节第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)DNA复制的主要特征第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成一、DNA以半保留方式进行复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成子链继承母链遗传信息的几种可能方式:

全保留式半保留式混合式第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成密度梯度实验:——实验结果支持半保留复制的设想。含15N-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制中的放射自显影图象第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成三、DNA复制反应呈半不连续特征3

5

3

5

解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leadingstrand)

。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链(laggingstrand)

。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成参与DNA复制的物质:底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPiRNA引物RNA引物子代DNA第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成聚合反应的特点:DNA新链生成需RNA引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性:5

3

外切酶活性:?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成（一）原核生物有3种DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成原核生物的DNA聚合酶第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成２个核心酶1个

-复合物（

、

、

、

、

、

6种亚基）1对

-亚基（可滑动的DNA夹子）DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成

亚基（130000）主要功能是合成DNA

亚基具有3

5

外切酶活性（复制保真性所必需）

亚基可增强其活性

亚基可能起组装作用核心酶由

、

和

亚基组成：两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成2个

-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用

-复合物由6种亚基组成：

、

、

、

、

、

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成功能：DNA-polⅠ（109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较E.Coli真核细胞

功能Ⅰ填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组Ⅱ复制中的校对，DNA修复

DNA修复

线粒体DNA合成Ⅲ

前导链合成DnaG

引物酶

后随链合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核生物的DNA聚合酶第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择利用“错配”实验发现，DNApolⅢ对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。

DNApolⅢ对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。DNApolⅠ的校读功能第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成E.Coli基因图第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态复制过程正超螺旋的形成：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成解链过程中正超螺旋的形成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成既能水解、又能连接磷酸二酯键。

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成拓扑酶的作用方式：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶的作用：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成提供核糖3

-OH提供5

-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3

,5

-磷酸二酯键生成的比较

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成原核生物DNA复制过程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三节第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。

需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、复制的起始第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5

3

5

3

（一）

DNA的解链第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成原核生物的复制起始部位及解链

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

（二）引物合成和引发体形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成引发体和复制叉的生成

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成二、DNA链的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成领头链的合成：领头链的子链沿着5

→3

方向可以连续地延长。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成后随链的合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成

在复制叉同时合成前导链和后随链第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成复制过程简图第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500三、复制的终止第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶

子链中的RNA引物被取代第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核生物DNA生物合成过程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes第四节第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶

/

转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。真核生物与原核生物DNA复制的差异：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。

复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。一、真核生物复制的起始与原核基本相似第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成酵母复制起点为自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）：酵母染色体含有多个复制起点。元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物──复制起点识别复合物(ORC)。

3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同。酵母复制起始点第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋TolⅠ和TolⅡDNA双螺旋解链，参与组装引发体DNA解旋酶连接冈崎片段DNA连接酶Ⅰ核酸酶，切除RNA引物RNAseHⅠ核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复Pol

/

合成RNA-DNA引物Pol

/引发酶有依赖DNA的ATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶，促使PCNA结合于引物-模板链RFC激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合DNARPA功能蛋白质真核DNA复制叉主要蛋白质的功能第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶

/

转换的原因是Pol

不具备持续合成能力。DNA聚合酶

/

转换的关键蛋白是RFC。DNA聚合酶

/

转换第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核DNA聚合酶转换和后随链合成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA后随链引物核小体三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成切除引物的两种机制第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成前导链产生完整的子染色单体。后随链3

端留下缩短的未复制的ssDNA区。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成。人的端粒重复序列为5’-(TnGn)x-3

。这些重复序列多为双链，但每个染色体的3’端比5

端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成。端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3

端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3

端。这些新合成的DNA为单链。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成端粒酶催化作用的爬行模型第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成前复制复合物在G1期形成而在S期被激活真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活。复制基因（replicator）是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成复制基因的选择出现于G1期，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物（pre-replicativecomplex，pre-RC）。复制起点的激活出现于细胞进入S期以后，这一阶段将激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1。复制起点识别复合物（origin

recognitioncomplex，ORC）识别并结合复制基因。三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7。前复制复合物（pre-RC）的形成第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其它复制因子并起始复制，复制因子包括3种DNA聚合酶。DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol

和Pol

结合，然后是Pol

/引发酶。在S期，pre-RC被蛋白激酶（Ddk和Cdk）磷酸化，从而被激活。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成pre-RC的激活和组装真核DNA复制叉第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成（1）激活pre-RC，以起始DNA复制；（2）抑制形成新的pre-RC。CDK控制pre-RC的形成和激活真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶（cyclin-dependentkinases，CDK）严格控制pre-RC的形成和激活。Cdk功能：第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活pre-RC。pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的pre-RC并迅速结合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其它组分结合ORC。只有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。第八版生物化学与分子生物学-DNA的生物合成逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第五节第八版生物化学与