蛋白质分离纯化及实验技术

第二章 蛋白质的分离纯化蛋白质分离纯化及实验技术第一节

能用作纯化依据的蛋白质性质第二节

蛋白质分离纯化的一般步骤第三节

蛋白质的分离纯化方法分离纯化蛋白质的目的:①将蛋白质和非蛋白质杂质分离②将不同的蛋白质相互分离。分离提纯蛋白质的要求：（1）纯度

（2）活性（3）得率 （4）速度蛋白质分离纯化及实验技术第一节

能用作纯化依据的蛋白质性质蛋白质分离纯化及实验技术1大小8密度2形状9配体结合能力3电荷10金属结合能力4等电点11可逆性缔合5电荷分布12特异性序列或结构6疏水性13非寻常性质7溶解度14基因工程构建的纯化标记1.

大小蛋白质的大小各不相同，可从含几个氨基酸的小肽（几百个Da）至含10

000多个氨基酸（上百万个Da）的巨大蛋白质不等。多数蛋白质的分子量在10

000—150

000Da之间。蛋白质分离纯化及实验技术2.

形状蛋白质形状有近似球形的，也有很不对称的。在离心、凝胶过滤或凝胶电泳过程中都会受

到形状的影响。蛋白质分离纯化及实验技术3.

电荷蛋白质的静电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷的总和。一蛋白质中，若天冬氨酸和谷氨酸残基占优势，在pH7.0时带净负电荷，则称之为酸性蛋白；若赖氨酸和精氨酸残基占优势，则认为是碱性蛋白质。蛋白质分离纯化及实验技术4.

等电点等电点（pI）是蛋白质上净电荷为零时的pH值，由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基数目和

滴定曲线所决定。蛋白质分离纯化及实验技术电荷分布电荷的氨基酸可均匀地分布于蛋白质的表面，亦可成簇地分布，使某一区域带强的正电荷而另一区域带强负电荷。这种非随机的电荷分布可用来通过离子交换层析来分离蛋白质。疏水性多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些可见于表面。蛋白质表面的疏

水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了

该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而

利用它来进行分级分离的能力。蛋白质分离纯化及实验技术溶解度蛋白质在不同溶剂中的溶解度有很大不同，

从基本不溶（<10mg/ml)直至极易溶解（>300mg/ml)不等。影响蛋白质溶解度的因素包括pH、离子强度、离子的性质、温度和溶剂的极性。蛋白质在其等电点处一般较不易溶解。密度多数蛋白质的密度在1.3—1.4g/cm3之间。分级分离蛋白质时一般不用这个性质。但是，在含有大量磷酸盐（如卵黄高磷蛋白，密度为1.8）或脂质部分（如脂蛋白，密度为1.03）的蛋白质，与一般蛋白质在密度上确有不同，可用密度梯度法将它们从大部分蛋白质中分离出来。蛋白质分离纯化及实验技术配体结合能力有许多酶能相当紧地域底物、效应分子、辅助因子和DNA模板。可利用亲和层析分离金属结合能力有许多酶能与某些金属离子（如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+)紧密结合。主要是其半胱氨酸或组氨酸残基可与金属离子作用，可通过金属离子螯合柱将酶固定。蛋白质分离纯化及实验技术可逆性缔合在某些溶液条件下，有一些酶能聚集成二聚体、四聚体等。如大肠杆菌RNA聚合酶在0.05mol/LNaCl溶液中形成二聚体，在0.3mol/L NaCl溶液中为单体，可利用这一性质，相继在不同条件下按大小进行分级分离。翻译后修饰许多蛋白质在合成后要通过加入糖基、酰基、磷酸基团或种种其他部分来进行修饰。这些

修饰提供了可用于分级分离的依据。如糖蛋

白能与含有外援凝集素的柱子结合，外源凝

集素是一类能牢固地与某些糖基部分结合的

分子。蛋白质分离纯化及实验技术特异性序列或结构氨基酸残基在蛋白质表面上的精确的几何表象

可用来作为分离方法的基础。例如，常可得到

只能识别蛋白质上的特定部位（表位）的抗体。把只能与待分离蛋白质结合的单特异性抗体连

接于填料上，可制备成免疫亲和柱。非寻常性质除上述各种性质外，某些蛋白质还有一些不寻常的性质，如不寻常的热稳定性、抗蛋白酶解的抗性等。例如大肠杆菌碱性磷酸酯酶的纯化，将细胞提取物加热后离心去除凝结的蛋白质，然后用蛋白酶处理含有磷酸酯酶的上清液，该酶消化剩余的杂蛋白，留下基本纯净的碱性磷酸酯酶。蛋白质分离纯化及实验技术15.

基因工程构建的纯化标记随着基因工程技术的进步，克隆编码某一蛋☎质的cDNA已变得比较容易。通过改变cDNA而在被表达蛋☎质的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的“标记”可用来作为一种有些的纯化依据。最通行的标记之一是在蛋白质的氨基端加上

6—10个组氨酸，这样可以使肽链能与Ni2+螯合柱紧密结合，经洗脱，再用游离咪唑洗脱或通过将pH降至5.9，使组氨酸充分质子化，与Ni2+分离而使蛋☎质得以纯化。蛋白质分离纯化及实验技术第二节

蛋白质分离纯化的一般步骤（二）粗分级（三）细分级（一）前处理动物材料应先剔除结缔组织蛋白质分离纯化及实验技术和脂肪组织；种子材料应先去壳甚至去种

皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。（一）前处理1、选材2、破碎3、混合物的分离蛋白质分离纯化及实验技术（二）粗分级分离盐析等电点沉淀有机溶剂分级分离超滤凝胶过滤（6)冷冻干燥蛋白质分离纯化及实验技术（三）细分级分离结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。蛋白质分离纯化及实验技术第三节

蛋白质的分离纯化方法蛋白质分离纯化及实验技术一、根据分子大小不同的纯化方法二、利用溶解度差别的纯化方法三、根据电荷不同的纯化方法四、利用选择性吸附的纯化方法五、利用配体的特异性亲和力的纯化方法一、根据分子大小不同的纯化方法蛋白质分离纯化及实验技术1.透析和超滤2.密度梯度离心3.凝胶层析1.透析和超滤透析——只用于除盐类和小分子杂质蛋白质分离纯化及实验技术透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质

如无机盐单糖等分开。常用

的半透膜：玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane

paper）火绵纸（赛璐玎纸,celloidin

paper）其他改型纤维素材料蛋白质分离纯化及实验技术超滤（ultrafiltration）——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液AB滤膜抽气滤膜离心蛋白质分离纯化及实验技术蛋白质分离纯化及实验技术2.密度梯度离心法（density

gradient）生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。品蔗糖密度梯度滴加样离心管

蔗糖浓度蛋白质分离纯化及实验技术密度梯度离心滴加样品4%塑料离心管8%12%16%20%分子量由小蔗糖浓度%—————

大蔗糖密度梯度（介质还可用：氯化铯、甘油等）蛋白质分离纯化及实验技术以Au纳米颗粒的分离的效果蛋白质分离纯化及实验技术胶体颗粒通过密度梯度超离心示意图3.凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分离大蛋白质、小蛋白质，除盐琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶（

Bio-GelP）蛋白质分离纯化及实验技术凝胶层析原理示意图蛋白质分离纯化及实验技术蛋白质分离纯化及实验技术蛋白质分离纯化及实验技术分子筛层析与洗脱曲线凝胶颗收集蛋白管从柱上面加缓冲溶液洗脱体积（Ve）凝胶柱蛋白质混合物粒

大分子

小分子质大分子

小分子V0

Ve1

Ve2蛋白质分离纯化及实验技术洗液的白浓洗脱体积（mL）logM蛋白质Mr=49,000r未知出中蛋质度Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“

选择性曲线”量的关系G-200G-100logMrav洗脱体积与相对蛋白质分分离纯化子及实验质技术二、利用溶解度差别的纯化方法蛋白质分离纯化及实验技术1.等电沉淀和pH控制2.蛋白质的盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离4.温度对蛋白质溶解度的影响1.等电沉淀和pH控制蛋白质分离纯化及实验技术蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点(pH

5.2-5.3)时达到最低值，在等电点两侧的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该

pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着

天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质分离纯化及实验技术低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(saltingin),盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就

是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，

引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解

度有显著的影响。3.有机溶剂分级分离蛋白质分离纯化及实验技术主要有乙醇、丙有机溶剂可以使蛋白质沉淀酮、乙酸乙酯等。有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。有分级分离现象要求对有机溶剂低温预冷。4.温度对蛋白质溶解度的影响蛋白质分离纯化及实验技术在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低。在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0 ℃或更低的温度下进行。三、根据电荷不同的纯化方法蛋白质分离纯化及实验技术1.电泳概述2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.毛细管电泳4.等电聚焦5.层析聚焦6.离子交换层析1.电泳概述蛋白质分离纯化及实验技术电泳：根据支撑物分：根据电泳槽类型分：根据蛋白质性质特点分：据电泳槽类型分垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳圆盘电泳蛋白质分离纯化及实验技术聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离纯化及实验技术聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。蛋白质分离纯化及实验技术聚丙烯酰胺凝胶性质加入分离胶溶

液

pH

8.8封水或饱和正丁醇溶液出倒出现水明或显正界丁面醇时，，

并分用离胶滤凝纸聚吸完干成（３０min~１h）蛋白质分离纯化及实验技术制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。

凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。分离胶pH

8.8加入浓缩胶溶

液

pH

8.6制备浓缩胶样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。插入样品梳蛋白质分离纯化及实验技术蛋白质分离纯化及实验技术加入电极缓冲液pH

8.3浓缩胶pH6.8通电分离胶pH

8.8加入样品蛋白质分离纯化及实验技术上样及电泳开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。蛋白质分离纯化及实验技术3.毛细管电泳毛细管电泳的原理蛋白质分离纯化及实验技术毛细管电泳

分离模式蛋白质分离纯化及实验技术毛细管区带电泳胶束电动色谱毛细管凝胶电泳毛细管等速电泳毛细管等电聚焦毛细管电色谱Waters

的CapLC-ESI-Q-Tof

Micro™毛细管液相-串级质谱联用仪蛋白质分离纯化及实验技术4.等电聚焦（isoelectric

focusing）原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使应用：高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质pH不同化合物能按其各自等电点得到分离。pH10pH3pI1=

pH8pI2=

pH7pI3=

pH5-+线性梯度蛋白质分离纯化及实验技术5.聚焦层析

Chromatofocusing）pH梯度溶液的形成示意图该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定的时

间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。流速移动速率蛋白质1（pI=7）

蛋白质2（pI=8）层析时的聚焦效应示意图蛋白质分离纯化及实验技术6.

离子交换层析（ion-change

chromatography）原理基质

疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用

制备纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分平衡阶段:离子交换剂与反离子结合吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用1蛋白质分离纯化及实验技术2345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度离子交换层析原理示意图蛋白质浓度带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管带负电荷的蛋白质蛋白质混合物玻璃柱带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质收集样品的管NaClNaCl梯度蛋白洗质分脱离体纯化积及实验技术梯度混合器蛋白质混合物凝胶颗粒

大分子

小分子储液瓶混合瓶层析柱磁力搅拌器洗脱剂浓度简单型梯度混合器洗脱剂体积（mL）梯度洗脱曲线洗脱剂浓度蛋白质分离纯化及实验技术储液瓶混合瓶复合型梯度混合器凸形线形凹形洗脱剂体积（mL）梯度洗脱曲线常用的阳离子交换剂离子交换剂可电离基团

可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基蛋白质分离纯化及实验技术常用的阴离子交换剂离子交换剂可电离基团

可电离基团结构AE-纤维素（弱减型）

氨基乙基PAB-纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸DEAE-纤维素

二乙基氨基乙基（中弱减型）DEAE-Sephadex

二乙基氨基乙基（中弱减型）DEAE

-纤维素（强减型）

二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）

二乙基（2-羟丙基）

-氨基乙基蛋白质分离纯化及实验技术四、利用选择性吸附的纯化方法蛋白质分离