酶的化学修饰

酶的化学修饰第五章

酶的化学修饰第一节

概述

第二节

酶分子化学修饰的方法学

第三节

酶分子侧链基团的化学修饰

第四节

有机大分子对酶的修饰

第五节金属离子置换修饰及物理修饰第六节

酶化学修饰的应用

第2页,共72页，2024年2月25日，星期天第一节

概述

一、概念二、进行化学修饰的原因三、化学修饰的基本原理四、修饰酶的特点第3页,共72页，2024年2月25日，星期天一、概念酶的化学修饰利用各种修饰剂具有的化学基团，与酶分子上某种氨基酸残基产生化学反应，使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术修饰酶在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶体外改造第4页,共72页，2024年2月25日，星期天二、进行化学修饰的原因稳定性不够，不能适应大量生产的需要作用的最适条件不符，活性不高临床应用的特殊要求：可能具有抗原性第5页,共72页，2024年2月25日，星期天三、化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第6页,共72页，2024年2月25日，星期天四、修饰酶的特点1、热稳定性增加2、增加抗抑制剂、抗蛋白水解酶能力，体内半衰期延长3、消除了酶的抗原性4、微环境稳定性增强，最适pH改变5、酶学性质改变第7页,共72页，2024年2月25日，星期天第一节结束概念进行化学修饰的原因

化学修饰的基本原理修饰酶的特点第8页,共72页，2024年2月25日，星期天第一节结束点击返回

第9页,共72页，2024年2月25日，星期天第二节

酶分子化学修饰的方法学

一、修饰需考虑的问题二、选择酶分子修饰剂三、修饰反应的一般程序四、测定修饰程度和修饰部位五、酶的修饰方法第10页,共72页，2024年2月25日，星期天一、修饰需考虑的问题1、

酶性质的了解(1)酶活性部位情况(2)酶的稳定条件、酶反应最适条件(3)酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等第11页,共72页，2024年2月25日，星期天一、修饰需考虑的问题2、选择反应条件(1)

反应体系中酶与修饰剂的分子比例(2)

反应体系的溶剂性质，pH条件和离子强度(3)

反应温度及时间(4)其它第12页,共72页，2024年2月25日，星期天二、选择酶分子修饰剂

修饰剂须具备的特性1、能选择性地与一个氨基酸残基反应2、

反应在保证酶蛋白不变性的条件下进行3、

被标记的残基在肽中稳定，容易通过降解分离出来并鉴定4、反应程度能用简单的技术测定第13页,共72页，2024年2月25日，星期天二、选择酶分子修饰剂

修饰剂的选择1、修饰剂的相对分子质量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性2、

修饰剂上反应基团的数目及位置3、

修饰剂上反应基团的活化方法与条件第14页,共72页，2024年2月25日，星期天三、修饰反应的一般程序修饰反应终止稀释阳离子交换洗涤过滤干燥第15页,共72页，2024年2月25日，星期天三、修饰反应的一般程序注意事项修饰后需进行总的氨基酸分析各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基进行确定注意缓冲液成分或修饰副产物对修饰部位和修饰程度及对酶活性的影响修饰后酶性质的改变第16页,共72页，2024年2月25日，星期天四、测定修饰程度和修饰部位修饰反应的评价因素1、

有多少修饰剂已结合到酶分子上2、

哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少3、

有多少种不同形式的修饰剂－酶分子耦合物，每种各有多少4、表面修饰、内部修饰

测定方法第17页,共72页，2024年2月25日，星期天五、

酶的修饰方法侧链基团的化学修饰大分子结合修饰其他(金属离子置换修饰、物理修饰)第18页,共72页，2024年2月25日，星期天第二节结束酶分子性质的了解

选择酶分子修饰剂

选择反应条件修饰反应要注意的其它问题修饰反应的一般程序测定修饰程度和修饰部位酶的修饰方法第19页,共72页，2024年2月25日，星期天第二节结束点击返回

第20页,共72页，2024年2月25日，星期天第三节

酶分子侧链基团的化学修饰

一、概述二、几种重要的修饰反应三、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰第21页,共72页，2024年2月25日，星期天一、概述侧链基团修饰采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法酶侧链基团组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等第22页,共72页，2024年2月25日，星期天一、概述作用研究各基团的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响(研究酶活性中心的必需基团)改变酶分子性质，提高实用价值测定某一基团在酶分子中的数量获得新酶种第23页,共72页，2024年2月25日，星期天一、概述类别蛋白类酶核酸类酶

侧链基团：磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基(酮基)等第24页,共72页，2024年2月25日，星期天二、几种重要的修饰反应酰化及其相关反应烷基化反应氧化还原反应芳香环取代反应第25页,共72页，2024年2月25日，星期天酰化及其相关反应第26页,共72页，2024年2月25日，星期天烷基化反应

第27页,共72页，2024年2月25日，星期天氧化和还原反应

第28页,共72页，2024年2月25日，星期天芳香环取代反应

定量测定第29页,共72页，2024年2月25日，星期天三、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰巯基氨基羧基咪唑基胍基二硫键第30页,共72页，2024年2月25日，星期天1、巯基的化学修饰

巯基：许多酶活性中心的催化基团；形成二硫键，稳定酶的结构巯基具有很强的亲核性，采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。提高酶的稳定性常用：酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠第31页,共72页，2024年2月25日，星期天第32页,共72页，2024年2月25日，星期天2、氨基的化学修饰

氨基的甲基化与乙酰化赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺的侧链氨基；谷氨酰胺和天冬氨酸羧基的-OH上甲基转移酶氨基的烷基化脱氨基作用或与氨基共价结合，屏蔽酶分子侧链上的氨基修饰剂：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯第33页,共72页，2024年2月25日，星期天第34页,共72页，2024年2月25日，星期天3、羧基的化学修饰

修饰剂与酶分子侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应修饰剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐酸试剂、异噁唑盐等第35页,共72页，2024年2月25日，星期天第36页,共72页，2024年2月25日，星期天4、咪唑基的化学修饰

组氨酸。许多酶活性中心的必需基团修饰剂通过咪唑基氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代进行修饰修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯第37页,共72页，2024年2月25日，星期天第38页,共72页，2024年2月25日，星期天5、胍基的化学修饰

精氨酸。在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用一些二羰基化合物在中性或弱碱性条件下与精氨酸胍基生成稳定的杂环修饰剂：丁二酮、1,2-环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等第39页,共72页，2024年2月25日，星期天第40页,共72页，2024年2月25日，星期天6、二硫键的化学修饰

同巯基基团类似还原方法与巯基修饰方法结合，阻止再氧化成二硫键。可用于计算断裂的二硫键数目修饰剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、过甲酸等第41页,共72页，2024年2月25日，星期天第42页,共72页，2024年2月25日，星期天第三节结束酰化及其相关反应烷基化反应氧化还原反应芳香环取代反应巯基的化学修饰氨基的化学修饰羧基的化学修饰咪唑基的化学修饰胍基的化学修饰二硫键的化学修饰概述

几种重要的修饰反应

特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰第43页,共72页，2024年2月25日，星期天第三节结束点击返回

第44页,共72页，2024年2月25日，星期天第四节

大分子结合修饰一、概念二、大分子结合修饰的方法三、大分子结合修饰的作用第45页,共72页，2024年2月25日，星期天一、概念利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法第46页,共72页，2024年2月25日，星期天二、大分子结合修饰的方法修饰剂的选择修饰剂的活化修饰分离第47页,共72页，2024年2月25日，星期天1、修饰剂的选择水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等PEG:1－10KD。溶解度高，无抗原性，无毒性，生物相容性好第48页,共72页，2024年2月25日，星期天2、修饰剂的活化需活化才能与酶分子侧链基团进行反应eg.单甲氧基聚乙二醇(MPEG)(1)聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1,MPEG2。对天冬酰胺酶等的氨基进行修饰(2)聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物SS-MPEG,SSA-MPEG,SC-MPEG。pH7-10条件下对酶分子氨基进行修饰(3)聚乙二醇马来酸酐衍生物PM。其中的马来酸酐通过酰胺键对酶分子上氨基进行修饰(4)聚乙二醇胺类衍生物对酶分子上的羰基进行修饰第49页,共72页，2024年2月25日，星期天3、修饰将活化大分子修饰剂与经分离纯化的酶液以一定比例混合，在一定温度、pH等条件下反应。使修饰剂活化基团与酶分子侧链基团共价结合，进行修饰第50页,共72页，2024年2月25日，星期天4、分离通过凝胶层析等方法，将具有不同修饰程度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶第51页,共72页，2024年2月25日，星期天三、大分子结合修饰的作用提高酶活力增强酶的稳定性降低或消除抗原性酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70ficoll(低分子量)-SOD14h140ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350天然SOD与修饰后SOD在人体血浆中的半衰期第52页,共72页，2024年2月25日，星期天第四节结束概念

大分子结合修饰的方法

大分子结合修饰的作用修饰剂的选择修饰剂的活化修饰分离提高酶活力增强酶的稳定性降低或消除抗原性第53页,共72页，2024年2月25日，星期天第四节结束点击返回

第54页,共72页，2024年2月25日，星期天第五节金属离子置换修饰及物理修饰一、金属离子置换修饰二、物理修饰第55页,共72页，2024年2月25日，星期天一、金属离子置换修饰1、

概念

把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法，称为金属离子置换修饰第56页,共72页，2024年2月25日，星期天一、金属离子置换修饰2、

方法

酶分离纯化除去原有金属离子加入置换离子加入金属螯合剂(EDTA)，形成螯合物，透析、超滤、分子筛层析等除去一般都是二价金属离子。例如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等只适用于哪些在分子结构中本来含有金属离子的酶第57页,共72页，2024年2月25日，星期天一、金属离子置换修饰3、

作用

阐明金属离子对酶催化作用的影响提高酶活力增强酶的稳定性改变酶的动力学特性第58页,共72页，2024年2月25日，星期天二、物理修饰1、

概念

通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法，称为酶分子的物理修饰第59页,共72页，2024年2月25日，星期天二、物理修饰2、

作用

了解在不同物理条件下，由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况探索极端环境中生物的生存可能性及其潜力提高酶的催化活性，增强酶的稳定性，改变酶的催化动力学特性第60页,共72页，2024年2月25日，星期天二、物理修饰3、

特点

不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变。只是副键发生某些变化和重排可在某些变性剂作用下，首先破坏酶分子原有的空间构象，然后在不同物理条件下，使酶分子重新构建新的空间构象第61页,共72页，2024年2月25日，星期天第五节结束金属离子置换修饰

物理修饰概念方法作用概念作用特点第62页,共72页，2024年2月25日，星期天第五节结束点击返回

第63页,共72页，2024年2月25日，星期天第六节

酶化学修饰的应用

一、在酶学研究方面的应用二、在医药方面的应用三、在工业方面的应用四、在有机介质酶催化反应中的应用化学修饰方法的局限性第64页,共72页，2024年2月25日，星期天一、在酶学研究方面的应用酶的活性中心研究酶的空间结构研究

采用具有荧光特性的修饰剂，可借助荧光光谱研究，分析各基团在酶分子中的空间分布情况采用巯基修饰剂，可了解酶分子中半胱氨酸的数目及分布情况，确定肽链的数目和二硫键的数目酶的作用机制研究了解各种残基及侧链基团在