食品微生物学第六章

食品微生物学第六章微生物检测技术：定量：微生物数量的测定定性：根据各种性状特征，对微生物的种类鉴别。第2页,共137页，2024年2月25日，星期天传统食品微生物检测：以分离、纯化、培养为基础现代食品微生物检测：新理论、新技术遗传学特性、细胞组分、数值分类快速、灵敏、特异第3页,共137页，2024年2月25日，星期天第一节食品中微生物数量的检测方法检测食品中微生物总数的方法：1）活细胞的标准平板计数法（Standardplatecount,SPC）2）最近似数测定法（mostprobablenumber,MPN）第4页,共137页，2024年2月25日，星期天检测食品中微生物总数的方法：3）染色还原技术估算具有还原能力的各种细胞的总数4）显微镜直接计数法（DMC）第5页,共137页，2024年2月25日，星期天一、传统的SPC方法活细胞的标准平板计数法（Standardplatecount,SPC）菌落总数计数法“活菌”标准方法意义：判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，也可观察微生物在食品中生长繁殖的动态。第6页,共137页，2024年2月25日，星期天菌落总数：在一定条件下（需氧、温度、时间、pH…)每克（每毫升）食品检验所生长出来的CFU（菌落形成单位）。第7页,共137页，2024年2月25日，星期天国标规定：在需氧条件下：细菌NA37℃48h

霉菌酵母PDA25~28℃5天第8页,共137页，2024年2月25日，星期天测定方法

检测样品的处理稀释倾注（涂布）琼脂平板计数报告第9页,共137页，2024年2月25日，星期天（一）样品采集1、采样原则：代表性防止污染2、采样的种类：大样一整批样品中样200g

小样分析的样品（检样）25g第10页,共137页，2024年2月25日，星期天3、采样方法：

无菌操作采样用具必须无菌尽量采集有包装的食品粉末状样品边取样边混合液体样品边振摇边混合冷冻食品保持冷冻状态非冷冻食品保存在0~5℃

第11页,共137页，2024年2月25日，星期天4、采样数量和部位：

200g/件乳制品一瓶（个、罐、听）粮三层五点（表、中、下）油重点采取表层及底层油5、采样标签：名称来源数量编号时间..（二）送检从采样到实验室越快越好

不得超过3h第12页,共137页，2024年2月25日，星期天（三）样品的处理和稀释1）取样无菌操作25g放入225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内（1：10稀释液）2）均匀混合均质器第13页,共137页，2024年2月25日，星期天3）稀释4）倾注1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml第14页,共137页，2024年2月25日，星期天5）倾注平板

稀释液移入平皿后，将46℃~的营养琼脂培养基注入平皿约15mL,转动平皿。空白对照第15页,共137页，2024年2月25日，星期天6）倒置

培养琼脂凝固后，翻转平板细菌37℃48h~

霉菌28℃5天第16页,共137页，2024年2月25日，星期天（四）菌落计数法

肉眼观察放大镜

TTC（氯化三苯基四氮唑)显色（五）菌落计数的报告报告单位：cfu/g(mL)1、平板菌落数的选择：

30~3002、稀释度的选择：第17页,共137页，2024年2月25日，星期天（五）菌落计数的报告3、菌落数的报告：

100以内时按实数报告大于100时两位有效数字

1640016000第18页,共137页，2024年2月25日，星期天涂布平板法

先倒平板待凝固后，吸取0.1ml稀释液于平板表面上，用灭菌涂布棒在整个平板上均匀涂布，培养观察。第19页,共137页，2024年2月25日，星期天涂布法的优缺点可检测到热敏性菌体菌落形态比较明显更适合于严格的好氧菌没有倾注法简便，易出现菌落重叠、混杂现象第20页,共137页，2024年2月25日，星期天二、旋转接种法（Spiralplatemethod）

1970年FDA原理：接种针将样品液以螺旋方式从平板中央往外连续接种。接种量：0.05mL第21页,共137页，2024年2月25日，星期天优点：可测定50~500000cfu/mL的菌数样品不需事先稀释不需做2个重复接种速度快结果可人工计数，也可用激光计数器计数人力与物力花费成本低廉测定结果与传统方法相关性高第22页,共137页，2024年2月25日，星期天缺点：设备投资较高含颗粒样品容易堵塞管道如果样品的带菌量超出范围则结果准确性降低对琼脂平板表面要求高第23页,共137页，2024年2月25日，星期天菌落计数的其它方法

膜过滤

MPN

染色还原计数法

DMC第24页,共137页，2024年2月25日，星期天三、膜过滤SPC方法的改良过滤膜的孔径0.45um

收集菌体提高检出率直接显微计数膜过滤与荧光染色方法结合第25页,共137页，2024年2月25日，星期天

直接荧光膜技术计数法（DEFT

）

DirectEpifluorescentFilterTechnique第26页,共137页，2024年2月25日，星期天DEFT—微菌落计数

仅用于活细胞的检测原理：食品匀液经DEFT膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至微菌落长出，显微镜观察

G-3hG+6h第27页,共137页，2024年2月25日，星期天快速检测技术特殊滤膜（0.5um）过滤样品液滤膜经啶橙染色紫外光显微镜观察活细胞橙色荧光死细胞绿色荧光

20~30min第28页,共137页，2024年2月25日，星期天四、最近似数测定法（MPN）

选择3个稀释梯度的稀释液，每种稀释液接种3管（5管）装有培养基的试管中培养，根据实验结果查MPN检索表，得到样品中微生物数量。第29页,共137页，2024年2月25日，星期天

1915年McCrady发明MPN的优点：方法相对简单与SPC相比，相似率较高用选择性培养基可检测特殊的微生物类群测定大肠菌群数量的方法第30页,共137页，2024年2月25日，星期天

MPN的缺点：需要大量的玻璃器皿（特别是5试管实验）不能观察微生物菌落的形态准确性不高第31页,共137页，2024年2月25日，星期天1、大肠菌群（coliformgroup）

领域用语与粪便污染有关的细菌定义：一群需氧及兼性厌氧，在37℃经24h能分解乳糖产酸、产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

第32页,共137页，2024年2月25日，星期天主要包括：大肠埃希氏菌属（Escherichia）柠檬酸杆菌属（Citrobacter）克雷氏菌属（Klebsiella）产气肠杆菌属（Enterobacter）非典型大肠杆菌典型大肠杆菌第33页,共137页，2024年2月25日，星期天

目前，大肠菌群已被我国和许多国家用作食品质量评价的指示菌。一般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的粪便。

第34页,共137页，2024年2月25日，星期天2、检测大肠菌群的意义

粪便污染食品的指示菌大肠菌群数的高低，表明粪便污染的程度和对人体健康危害性的大小肠道致病菌污染食品的指示菌

大肠菌群数的高低，表明肠道致病菌存在的可能性大小（并非一定平行！）

第35页,共137页，2024年2月25日，星期天3、大肠菌群检测方法与检验结果

检验结果：用每100mL（g）样品中大肠菌群最近似数来表示，简称大肠菌群MPN.检测方法：乳糖发酵试验、分离培养、证实试验见GB4789.3-1994第36页,共137页，2024年2月25日，星期天五、染色还原计数法一种估计活性微生物数量的方法。原理：活细胞内含有还原酶，可把特定的染料从一种颜色还原为另外一种颜色。第37页,共137页，2024年2月25日，星期天亚甲基蓝（兰色）白色刃天青（暗兰色）粉红色或白色染色还原的时间与样品中微生物浓度成反比两种染料：第38页,共137页，2024年2月25日，星期天应用：乳品工业上原料乳中的微生物检测优点：简便、快捷和经济缺点：不同的微生物还原能力不同，给估算带来了一定的困难。不适用于含有还原酶的食品应用及优、缺点第39页,共137页，2024年2月25日，星期天六、显微直接计数法

（Directmicroscopecount,DMC）一定量的食品（0.001mL）显微镜载玻片（1cm2）烘干、固定、脱脂、染色复式显微镜计数换算第40页,共137页，2024年2月25日，星期天DMC方法的优点

快捷、简便能对细胞形态进行分析载玻片易保存，作参考可使用荧光技术增强效果第41页,共137页，2024年2月25日，星期天DMC方法的缺点

仅适于检含大量菌体的样品准确性差易造成操作人员的疲劳第42页,共137页，2024年2月25日，星期天七、棉拭子涂抹法

表层微生物的检测应用于食品、公共场所第43页,共137页，2024年2月25日，星期天方法：1）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水（10mL试管）均匀涂抹样品表面一定面积（5cmX5cm，1cmX1cm）后，放回试管中，及时送检；第44页,共137页，2024年2月25日，星期天2）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液中；3）按SPC方法进行梯度稀释、培养、计数。

此外，纸片法……第45页,共137页，2024年2月25日，星期天第二节物理、化学、分子和免疫方法第46页,共137页，2024年2月25日，星期天一、物理方法

阻抗测定法微量量热法第47页,共137页，2024年2月25日，星期天（一）阻抗测定法（impedance）

1899年G.N,Stewart

估算20世纪70年代应用阻抗：交流电路中导电物质对电流所起的阻碍和抵抗作用，可由电导和电容计算。第48页,共137页，2024年2月25日，星期天原理：微生物可使培养基中电惰性底物，如碳水化合物、蛋白质等营养物质代谢成为电活性产物（乳酸盐或氨等）当微生物生长繁殖时，培养基中的电惰性分子即为许多电活性分子所取代，从而使培养基的电导性增大，培养基的阻抗降低。第49页,共137页，2024年2月25日，星期天检测时间（detectiontime)

样品接种后从开始培养到阻抗值发生急剧变化的时间。与原始菌数成反比

Bactomer细菌计数器准确率93%10~100个

5h~第50页,共137页，2024年2月25日，星期天（二）微量量热法（Microcalorimetry）细菌生长时产生热量测定微小温度变化的仪器—量热计批次型：早期应用流动型：灵敏、快速第51页,共137页，2024年2月25日，星期天二、化学方法（一）热稳定性核酸酶（DNAse）

S.aureusG（+）凝固酶（+）产肠毒素菌株95%产热稳定性核酸酶耐高温第52页,共137页，2024年2月25日，星期天原理：检测食品中热稳定性核酸酶的含量，可以精确计算出金黄色葡萄球菌的数量。第53页,共137页，2024年2月25日，星期天

分光光度法

热稳定性核酸酶是S.aureus生长的标志凝固酵素是产肠毒素菌株的标志第54页,共137页，2024年2月25日，星期天（二）ATP的测定生命体的主要能源细胞中ATP含量恒定ATP测定计数法的原理根据ATP可与从荧火虫中提取的荧光素酶作用发光，发光的总光量与ATP的量成正比。第55页,共137页，2024年2月25日，星期天

光强度推算出细菌细胞数液体发光分光计照度计结果与SPC法一致10~25min第56页,共137页，2024年2月25日，星期天ATP检测法的应用：

检测微生物数量的快速方法医学：尿样的检验环境卫生：表面微生物的测定第57页,共137页，2024年2月25日，星期天（三）辐射测量法（Radiometric）

原理

利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2的原理，把微量元素标记到葡萄糖或其他糖类分子中。放射能计数器第58页,共137页，2024年2月25日，星期天放射物的种类

C-14葡萄糖C-14甲酸盐

C14-谷氨酸盐放射量与菌数成正比检测C-14所需的时间与食品中微生物的含量成反比。第59页,共137页，2024年2月25日，星期天应用医学：“吹口气，查胃病”

30min

食品：微生物含量高5~6h

微生物含量低更厂第60页,共137页，2024年2月25日，星期天三、食品微生物的指纹识别和鉴定

“指纹”概念由于每种微生物的化学组分（DNA、蛋白质）结构、性能有差别及其特异性代谢产物等通过分析技术出现的特征性的图谱第61页,共137页，2024年2月25日，星期天（一）血清学方法特殊的抗体鉴定同源抗原

G-菌体（O）抗原鞭毛（H）抗原热稳定性好热稳定性差第62页,共137页，2024年2月25日，星期天抗原（Antigen，Ag）Antigensaremacromoleculesthatelicitanimmuneresponseinthebody.Antigenscanbeproteins

polysaccharides

conjugatesoflipidswithproteins(lipoproteins)andpolysaccharides(glycolipids).第63页,共137页，2024年2月25日，星期天Antibodiesareimmunesystem-relatedproteinscalledimmunoglobulins（Ig）.Eachantibodyconsistsoffourpolypeptides–twoheavychainsandtwolightchainsjoinedtoforma"Y"shapedmolecule.抗体（Antibody，Ab）第64页,共137页，2024年2月25日，星期天Structureofantibody第65页,共137页，2024年2月25日，星期天（二）噬菌体（phage）类型原理：根据噬菌体和它的宿主细菌之间的特殊关系，用已知的噬菌体鉴定其特定的宿主细菌。第66页,共137页，2024年2月25日，星期天（三）分子生物学方法

基因探针技术

DNA扩增法限制性片段长度多态性技术脉冲场凝胶电泳第67页,共137页，2024年2月25日，星期天1.基因探针技术探针（Probe）：经过标记的一段短核苷酸，用于检测与之同源的核苷酸序列。Probeisashortlabellednucleotideusedtodetecthomologousnucleotidesequence.第68页,共137页，2024年2月25日，星期天Lengthofprobe：

20-1000bpTypeofprobe：

Oligonucleotideprobes

（20-40bp）SinglestrandedDNAprobes

（200-500bp

）DoublestrandedDNAprobes

RNAprobesorRiboprobes第69页,共137页，2024年2月25日，星期天

Radioactive：32P、35S、3H、14CDigoxigenin

（Dig）BiotinFluorescentdyeChoiceofLabelling：

Non-radioactive：第70页,共137页，2024年2月25日，星期天UnknownDNA第71页,共137页，2024年2月25日，星期天Colony

hybridization第72页,共137页，2024年2月25日，星期天

可检测的细胞数量：106-107

必须进行细胞富集！

探针检测的灵敏度与检测时间细胞数量为108，检测需要10-12h第73页,共137页，2024年2月25日，星期天2.DNA扩增法（1）多聚酶链反应

PolymeraseChainReaction，PCR1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传学研究室的KaryMullis发明

1993年，Mullis获得诺贝尔化学奖第74页,共137页，2024年2月25日，星期天PCR的基本原理DNA的结构DNAdoublehelix第75页,共137页，2024年2月25日，星期天DNA的复制DNAsemi-conservedreplication第76页,共137页，2024年2月25日，星期天第77页,共137页，2024年2月25日，星期天第78页,共137页，2024年2月25日，星期天三步曲：变性（Denaturation）退火（Annealling）延伸（Extension）一个循环（cycle）一般进行25-30个循环PCR反应的三步曲与五要素第79页,共137页，2024年2月25日，星期天Step1：双链DNA热变性（94℃）；Step2：引物与模板单链DNA退火（55℃）；Step3：DNA的聚合延伸反应（72℃）；Step4：扩增的双链DNA再次热变性（返回Step1）。第80页,共137页，2024年2月25日，星期天五要素：●模板DNA（template）●引物（Primer）●DNA聚合酶（Polymerase）●缓冲液（Buffer，Mg++）●脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）第81页,共137页，2024年2月25日，星期天第82页,共137页，2024年2月25日，星期天循环次数与产物的量实际：Nf=N0（1+Y）N其中Y为扩增效率理论：Nf=N0X2N

其中N为循环次数，N0为起始拷贝数，Nf为最终拷贝数第83页,共137页，2024年2月25日，星期天PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳第84页,共137页，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCTemperature100055Time5’3’3’5’第85页,共137页，2024年2月25日，星期天PCRDenaturing94oCTemperature100055Time3’5’5’3’Heat第86页,共137页，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time3’5’5’3’5’5’Denaturing94oC第87页,共137页，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCDenaturingng94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’第88页,共137页，2024年2月25日，星期天Denaturing94oCDenaturing94oCAnnealingPrimers55oCExtension72oCTemperature100055Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’第89页,共137页，2024年2月25日，星期天PCRProductsWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664第90页,共137页，2024年2月25日，星期天（2）随机扩增的多态性DNA

RandomAmplifiedPolymorphicDNA

（RAPD）DevelopedbyWilliamsetal.(1990)using10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAsRAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint第91页,共137页，2024年2月25日，星期天Tworelatedtechniques:

1.ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)WelshandMcClelland(1990)longerprimers(18-25bases)2.DNAAmplificationFingerprinting(DAF)Caetano-Anollesetal.(1991)veryshortprimers(8bases)第92页,共137页，2024年2月25日，星期天ComponentsofPCRandRAPDRAPD1.Buffer(Mg++)–usuallyhighMg++concentration2.TemplateDNA1shortprimer(10bases)annealstoanyspecificpartofthetemplateDNA4.dNTPs5.TaqPCR1.Buffer(Mg++)2.TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPs5.Taq第93页,共137页，2024年2月25日，星期天TwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36°C-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNAMorethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.第94页,共137页，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPD第95页,共137页，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPD第96页,共137页，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPD第97页,共137页，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesRAPD第98页,共137页，2024年2月25日，星期天TemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPD第99页,共137页，2024年2月25日，星期天MM2345678910RAPD产物的电泳图谱第100页,共137页，2024年2月25日，星期天PCRMachine第101页,共137页，2024年2月25日，星期天3.限制性片段长度多态性技术（RFLP）RestrictionFragmentLengthPolymorphism（1）限制性内切酶

(Restrictionendonuclease）保护细菌不受外来DNA侵入来自细菌的一种内切酶第102页,共137页，2024年2月25日，星期天限制性内切酶的特点：识别4-8bp特定序列(sitespecific)两股DNA上各产生一个切口回文序列(palindromesequence)5’-GTTACATGAGATCACGGATTC-3’3’-CAATGTACTCTAGTGCCTAAG-5’第103页,共137页，2024年2月25日，星期天产生粘性末端(cohesiveend,stickyend)5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAEcoRI5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCMspIAATTCACGGATTC-3’GTGCCTAAG-5’CGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’5’-GTTACATGAG3’-CAATGTACTCTTAAAATTCACGGATTC–3’GTGCCTAAG-5’5’-TTACATGC3’-AATGTACGGCCGGACGGAT-3’CTGCCTA-5’第104页,共137页，2024年2月25日，星期天5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAHpaI5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCHaeIIIAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’CCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’产生平末端(bluntend)5’-ACGGATTCGTT3’-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA

3’TTGCAATGTACT

5’5’-AACTGTCGG3’-TTGACAGCCCCAGGCTG-3’GGTCCGAC-5’第105页,共137页，2024年2月25日，星期天（2）限制性图谱

(Restrictionmap）第106页,共137页，2024年2月25日，星期天（3）限制性片段长度多态性

(RFLP）第107页,共137页，2024年2月25日，星期天第108页,共137页，2024年2月25日，星期天4.脉冲场凝胶电泳技术

PulsedFieldGelElectrophoresis（PFGE）第109页,共137页，2024年2月25日，星期天第110页,共137页，2024年2月25日，星期天四、免疫学方法精确性(Accurate)灵敏性(Sensitive)特异性(Specific)第111页,共137页，2024年2月25日，星期天（一）荧光抗体法（FA）（Fluorescenceantibody）

1942年创立，在食品和医学微生物中应用广泛。原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察，也可计数。第112页,共137页，2024年2月25日，星期天荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）若丹名B（RhodamineB）第113页,共137页，2024年2月25日，星期天（二）沙门氏菌1-2实验（1-2Test）原理：血清学原理,即抗原抗体结合形成肉眼可见的免疫带。一种检测有动力的沙门氏菌的方法第114页,共137页，2024年2月25日，星期天

在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进行：一个容器中装有选择性液体培养基，另一个中装有非选择性运动性培养基（半固体），并含有鞭毛抗体。恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。第115页,共137页，2024年2月25日，星期天Inoculationchamber第116页,共137页，2024年2月25日，星期天优点：将血清学反应和生化增菌过程结合起来，特异性强；不需特殊实验室条件，简便；

8-14小时内得出结果，快速。缺点：不能检测非运动型沙门氏菌，免疫条带的判断有主观因素。第117页,共137页，2024年2月25日，星期天（三）酶联免疫吸附剂测定

EnzymeLinkedImmunosorbentAssay1971年Engvall和Perlmann（ELISA）canmeasureantibodiesorantigensinexpensive,rapid,quantitative,specificsensitive(pg/ml)expensiveequipmentnotrequiredcanbeautomated第118页,共137页，2024年2月25日，星期天ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。原理：第119页,共137页，2024年2月25日，星期天待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应，加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相载体上。此时固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。第120页,共137页，2024年2月25日，星期天ELISA可用于测定抗原或抗体。测定中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”