转基因技术与作物育种

转基因技术与作物育种四、受体细胞(receptorcell)(一)定义受体细胞又称宿主细胞(hostcell)，指能摄取外源DNA(基因)并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。

(二)种类

*原核生物受体细胞*植物受体细胞*动物受体细胞第2页,共73页，2024年2月25日，星期天(三)受体细胞选择的基本原则*便于重组DNA分子导入和筛选克隆子。*能使重组DNA分子稳定存在于细胞内。*适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累，对于真核目的基因的高效表达，应具有较好的翻译后加工机制。*遗传稳定性高，对遗传密码的应用上无明显偏倚性。*易于扩大培养或发酵生长，具有较高的生产应用和理论研究价值。*安全性高，无致病性，不会对环境造成污染。第3页,共73页，2024年2月25日，星期天

容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，用作cDNA文库和基因组文库的受体菌。大肠杆菌蓝藻农杆菌(四)原核生物受体细胞第4页,共73页，2024年2月25日，星期天酵母(五)酵母受体细胞

酵母菌是最简单的真核单细胞生物；

是外源真核基因最理想的表达体系。

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一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。(六)植物受体细胞第6页,共73页，2024年2月25日，星期天

常采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞。体细胞可表达基因产物，并且通过体细胞培养出了多种克隆动物。体细胞不易再分化成个体，(七)动物受体细胞第7页,共73页，2024年2月25日，星期天第三基因工程技术路线DNA片段的取得(目的基因的分离和制备)DNA片段和载体的连接——重组体DNA外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库筛选与鉴定克隆子(含目的基因)目的基因表达√√？第8页,共73页，2024年2月25日，星期天一、重组体DNA导入受体细胞受体:原核生物细胞、真核生物细胞原核生物细胞：大肠杆菌真核生物细胞：酵母导入方法：目前有很多种方法，但采用哪一种应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定

第9页,共73页，2024年2月25日，星期天指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。

1、重组DNA分子导入原核生物细胞感受态细胞第10页,共73页，2024年2月25日，星期天

携带目的基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程。(1)转化(transformation)质粒为载体第11页,共73页，2024年2月25日，星期天(2)转导(transduction)

通过噬菌体(病毒)颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程。

含目的基因的DNA与噬菌体(病毒)载体的重组DNA分子导入受体细胞前，必须进行体外包装。第12页,共73页，2024年2月25日，星期天

将被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌、含广泛宿主辅助质粒的辅菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内。(3)三亲本杂交(triparentalmating)第13页,共73页，2024年2月25日，星期天

由于真核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。2、重组DNA分子导入真核生物细胞第14页,共73页，2024年2月25日，星期天(1)重组DNA分子导入植物细胞第15页,共73页，2024年2月25日，星期天

Ti质粒载体与含目的基因的DNA片段重组，导入根癌农杆菌，再采用叶盘转化法、原生质体共培养法和悬浮细胞共培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。1)根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化第16页,共73页，2024年2月25日，星期天

将植物材料的叶片进行表面灭菌，用无菌的打孔器从叶片上取下圆形小片，接种含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌。由圆形小片长出的愈伤组织通过筛选培养和再分化培养就可以获得转基因植株。叶盘转化第17页,共73页，2024年2月25日，星期天

取含Ti质粒载体重组DNA的致癌农杆菌，同刚再生细胞壁的植物原生质体进行短暂的共培养，使重组DNA导入细胞，经筛选和再分化培养获得转基因植株。原生质体共培养转化第18页,共73页，2024年2月25日，星期天

此方法类似原生质体共培养转化法，不同的是首先建立植物悬浮细胞系。悬浮细胞共培养转化根癌农杆菌介导法一般用于双子叶植物。第19页,共73页，2024年2月25日，星期天

将含目的基因的外源DNA同金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。

金属微粒在外力作用，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，植物细胞仍能维持正常的生命活动。2)微弹轰击(bombardment)基因枪(genegun)法第20页,共73页，2024年2月25日，星期天

将重组DNA涂于授粉的柱头上，或微量注射器将DNA注入子房，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠的卵、合子和心进人胚囊，转化尚不具有正常细胞壁早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。3)花粉管通道法第21页,共73页，2024年2月25日，星期天

聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，尤以PEG应用最广。4)多聚物介导法

多聚物同二价阳离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+)和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。第22页,共73页，2024年2月25日，星期天细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。

植物原生质体同外源DNA分子混合，置于电击仪的样品室中，进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。5)电穿孔法第23页,共73页，2024年2月25日，星期天

在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。此方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。6)激光微束穿孔

利用直径很小、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔第24页,共73页，2024年2月25日，星期天

带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上；(2)重组DNA分子导入哺乳动物细胞1)病毒颗粒转导病毒DNA或RNA构建载体的转导过程主要有三种类型

带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞；

带有目的基因的病毒基因组是缺陷型的，但是被感染的受体细胞的基因组中已整合了病毒缺失的基因。第25页,共73页，2024年2月25日，星期天动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀2)化学处理二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-dextran)磷酸钙二甲基亚砜促进哺乳动物细胞捕获外源DNA分子使细胞表面增加对外源DNA的吸附能力，增加膜的通透性第26页,共73页，2024年2月25日，星期天

由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导入受体细胞。3)脂质体介导(liposome)第27页,共73页，2024年2月25日，星期天

处于细胞周围的DNA随微针穿刺形成的小孔进入细胞，或随穿刺的针头带入细胞。

显微注射法把外源DNA分子直接注入细胞4)显微注射“穿刺”第28页,共73页，2024年2月25日，星期天原理和操作过程类似植物细胞的电穿孔转移5)电穿孔第29页,共73页，2024年2月25日，星期天二、克隆子的筛选克隆子摄取外源DNA并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞。转化子采用转化方法获得的克隆子。重组子真正含有重组DNA分子的转化子。第30页,共73页，2024年2月25日，星期天ampr(抗氨苄青霉素)、cmpr(抗氯霉素)、kanr(抗卡那霉素)、tetr(抗四环素)和strr(抗链霉素)等。1、根据载体选择标记基因筛选转化子抗菌素抗性基因和lacZ′基因目前常用的选择标记基因(1)抗菌素抗性基因和相应的选择药物筛选抗性基因第31页,共73页，2024年2月25日，星期天

把含目的基因的DNA片段插入其中之一选择标记基因区，导致该基因的插入失活。双抗选择标记载体第32页,共73页，2024年2月25日，星期天epsps基因(2)载体除草剂抗性基因和相应的选择药物筛选

抗草甘膦第33页,共73页，2024年2月25日，星期天

具完整乳糖操纵子的菌体能翻译β-半乳糖苷酶(Z)、透性酶(Y)和乙酰基转移酶(A)。当培养基中含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)时，可产生蓝色沉淀物，使菌落成蓝色。

(3)乳糖操纵子lacZ'基因筛选

含乳糖操纵子缺陷型(lacZ')的载体转化互补型菌株，在含X-gal和IPTG的培养基中培养，克隆子是蓝色菌落，而未转化的互补型菌株的菌落是白色的。第34页,共73页，2024年2月25日，星期天

当含目的基因的DNA片段插入lacZ'基因区，即使转化互补型菌株细胞，在含X-gal和IPTG的培养基中，也是长出白色的菌落。根据菌落的蓝、白颜色筛选出含目的基因的克隆子。

由于互补菌株本身长成白色菌落的干扰，在构建载体时再组装一种供抗药性筛选的基因(ampr等)。第35页,共73页，2024年2月25日，星期天(5)核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选(4)生长调节剂非依赖型筛选第36页,共73页，2024年2月25日，星期天定义：其编码产物能够被快速地检测，用来判断外源DNA是否已导入到受体细胞并检测其表达活性的一类特殊的基因。1.表达产物及其功能在未转化的细胞内不存在2、利用报告基因筛选转化子报告基因(reportergene)报告基因必须具有两大特点2.便于检测

通常在含目的基因的DNA片段与克隆载体连接之前，先在目的基因上游或下游连接一个报告基因。第37页,共73页，2024年2月25日，星期天gus染色的棉花胚状体常用的报告基因*gus(β-葡萄糖酸酶)基因gus基因产物能够分解4-甲基伞形花酮-β-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮第38页,共73页，2024年2月25日，星期天转基因烟草来自荧火虫的荧光素酶*

luc(荧光素酶)基因荧光素+ATP腺苷酸荧光素酰化复合物LUC氧化脱羧氧化荧光素第39页,共73页，2024年2月25日，星期天*

gfp(绿色荧光蛋白)基因绿色荧光蛋白395nm荧光蛋白第40页,共73页，2024年2月25日，星期天3、根据噬菌斑筛选重组DNA分子(目的基因+载体)必须达到野生型λDNA的75%~105%才能够进行体外包装。第41页,共73页，2024年2月25日，星期天1、根据重组DNA分子大小鉴定(一)、根据重组DNA分子特征鉴定从克隆子提取DNA，经凝胶电泳检测。三、重组子的鉴定第42页,共73页，2024年2月25日，星期天

从克隆子提取DNA，用合适的限制性内切酶切，经凝胶电泳检测，若酶切片段数量和大小同原来用于转化的外源DNA被这些酶切割的结果一致。2、限制性内切酶分析第43页,共73页，2024年2月25日，星期天

根据含目的基因两端已知核苷酸序列，设计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因。3、PCR分析优点：灵敏、快速，并且可证实是完整的目的基因第44页,共73页，2024年2月25日，星期天杂交方法：斑点杂交、噬菌斑杂交4、分子杂交法DNA杂交P48：两个不同来源的单链DNA分子的核苷酸互补时，在复性条件可形成双链DNA。和DNA印迹(southernblotting)DNA杂交探针P48

：指带有某种标记物的特异性核苷酸序列，能与该核苷酸序列互补的DNA进行退火杂交，并可根据标记物的性质进行有效的检测。杂交探针种类：32P、生物素、地高辛或荧光素第45页,共73页，2024年2月25日，星期天

提取待鉴定的转化子的总DNA，直接点样在分子杂交的膜上，用含目的基因DNA互补片段的探针与其杂交，若出现明显的杂交信号，可认为是真的克隆子。(1)斑点杂交法第46页,共73页，2024年2月25日，星期天

菌落或噬菌斑直接转移到用于分子杂交的膜上，先经溶菌和变性处理后，再用探针进行杂交。(2)菌落杂交或噬菌斑杂交第47页,共73页，2024年2月25日，星期天DNA分子限制片段与放射性标记DNA探针杂交带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上放射自显影用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜(3)southern杂交(southernblotting)

提取总DNA，经限制性内切酶切割，再用凝胶电泳、变性，转移到杂交膜上，用探针与其杂交。第48页,共73页，2024年2月25日，星期天5、应用DNA芯片鉴定提取DNA或RNA并用荧光标记与芯片杂交第49页,共73页，2024年2月25日，星期天

以上方法可断定克隆子含有目的基因，但并不能了解目的基因的核苷酸序列。

6、根据DNA核苷序列鉴定第50页,共73页，2024年2月25日，星期天(二)、根据目的基因转录产物(mRNA)鉴定

在一定条件下，RNA可以同转录该RNA的模板DNA链进行杂交RNA印迹(northern

blotting)

制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总RNA杂交，若出现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目的基因转录出相应的mRNA。第51页,共73页，2024年2月25日，星期天

基因的最终表达产物是蛋白质(酶)，因此检测蛋白质的一些方法可用于检测目的基因的表达产物。(三)、根据目的基因翻译产物的鉴定第52页,共73页，2024年2月25日，星期天1、蛋白质凝胶电泳鉴定重组子由于含外源基因，其表达产物中增加了外源基因表达的多肽(蛋白质)第53页,共73页，2024年2月25日，星期天2、免疫检测鉴定

以细胞内表达的蛋白为抗原，用对应的特异性抗体进行鉴定。第54页,共73页，2024年2月25日，星期天酶联免疫吸附(ELISA)enzyme-linked

immunosorbentassay

固－液、抗原－抗体体系，通过酶反应检测抗体与抗原的结合第55页,共73页，2024年2月25日，星期天

基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域。具有生长激素的转基因鼠第四节基因工程的应用第56页,共73页，2024年2月25日，星期天第三转基因作物的生物安全性第57页,共73页，2024年2月25日，星期天

直至今天，转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论。反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品”（frankensteinfood）。Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造、最终又毁灭了这个科学家的怪物。那么，人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己，还是拯救自己呢？第58页,共73页，2024年2月25日，星期天对转基因作物的安全性争论，国际上有几个典型的事件。

Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年５月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。

第59页,共73页，2024年2月25日，星期天

斑蝶事件：

1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼虫死亡。这一实验结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外５米，马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用１０倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。

第60页,共73页，2024年2月25日，星期天

加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，并怪罪于转基因。基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。举例来说，小麦由Ａ、Ｂ、Ｄ三个基因组组成，它是由分别带有Ａ、Ｂ、Ｄ基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没有道理的。第61页,共73页，2024年2月25日，星期天中国Ｂt抗虫棉破坏环境事件：

2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，６月４日《Chinadaily》上发表了题为“GMCottonDamageEnviroment”的文章。当天,绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响。６月５日德国《农业报》发表了题为“中国研究：Ｂｔ棉破坏环境巨大”。绿色和平组织的“中国项目主管”声称：“棉农将面对不受控制的超级害虫”、“转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。事实上，抗虫棉在中国实践多年，深受广大棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。第62页,共73页，2024年2月25日，星期天争论的实质

现在转基因作物的安全性已经成了国际贸易的技术壁垒。由于某些媒体的炒作，对消费者的心理和转基因作物的产业化已经产生了很大的负面影响。我们的判断？第63页,共73页，2024年2月25日，星期天我们所要了解的---转基因植物的潜在风险:1.转基因植物释放引发“超级杂草”目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。第64页,共73页，2024年2月25日，星期天2.转基因植物中35S启动子的生物安全性启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达空间、表达时间和表达强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。因此已经被引入许多转基因植物中。潜在风险问题:35S启动子内有一重组热点。（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。第65页,共73页，2024年2月25日，星期天3.抗生素抗性标记基因的生物安全性抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播。目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。在过去的几年里，越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。抗性标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移至体内微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。抗性标记基因产物是否使人体产生抗药性（食品安全性）。第66页,共73页，2024年2月25日，星期天4.转基因食品的安全性1994年美国Caigene公司的转基因延熟番茄经FDA批准上市，成为第一例通过安全评价的转基因植物食品。转基因食品对人类的可能危害主要有3大类：（1）可能含有已知或未知的毒素，对人体产生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的过敏源，引起人体的过敏反应。（3）食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症。第67页,共73页，2024年2月25日，星期天国外对转基因食品管理的现状

1.国际组织

实质等同原则表型性状的等同成分等同

2000年《卡塔赫纳生物安全协定书》62个国家签署

2001年《生物安全议定书》130多个国家签署

2003年《生物技术食品的风险评估草案》226个国家表示欢迎第68页,共73页，2024年2月25日，星期天2.美国◆1992年美国公布了转基因作物不需由作市场前评价，除非它引起新的安全性问题。2000年4月，在国会科学委员会下属的基础研究委员会的调查报告中，坚持认为没有科学的证据之前不能将GMF作为一个新的食品级别◆2000年1月美国政府对转基因玉米的种植颁布了限令，以防止害虫对转基因玉米中毒素形成抗药性。美国环境保护局限令美国大部分玉