课题分解纤维素的微生物的分离

课题分解纤维素的微生物的分离第2页,共43页，2024年2月25日，星期天

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。课题背景草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？第3页,共43页，2024年2月25日，星期天纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成。基础知识（一）纤维素与纤维素酶第4页,共43页，2024年2月25日，星期天

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素纤维二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶第5页,共43页，2024年2月25日，星期天①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失

讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？第6页,共43页，2024年2月25日，星期天

在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。实验分析：该小实验是如何构成对照的？第7页,共43页，2024年2月25日，星期天下列生物能分解纤维素的是（）①人②兔③牛④蘑菇⑤纤维杆菌A.①②③④⑤B.②③⑤C.②③④⑤D.③⑤C第8页,共43页，2024年2月25日，星期天（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法是__________________________________

该方法可以通过________反应直接筛选。刚果红（CongoRed）染色法颜色第9页,共43页，2024年2月25日，星期天2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成____________，当纤维素被_________分解后，红色复合物无法形成，出现以_____________为中心的________，我们可以通过____________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌

透明圈是否产生透明圈第10页,共43页，2024年2月25日，星期天第11页,共43页，2024年2月25日，星期天练一练：1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖第12页,共43页，2024年2月25日，星期天2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛

选出了纤维素分解菌第13页,共43页，2024年2月25日，星期天土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落实验设计(三)第14页,共43页，2024年2月25日，星期天①分布环境1、土壤取样：富含纤维素的环境中操作步骤

生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②原因第15页,共43页，2024年2月25日，星期天③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。第16页,共43页，2024年2月25日，星期天2、选择培养

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

①目的：②制备选择培养基：③操作：

将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。第17页,共43页，2024年2月25日，星期天培养基成分分析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮源、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水第18页,共43页，2024年2月25日，星期天提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。A、以上配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用第19页,共43页，2024年2月25日，星期天

说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。第20页,共43页，2024年2月25日，星期天

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？第21页,共43页，2024年2月25日，星期天比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养基原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上固体培养基液体培养基筛选菌株选择培养第22页,共43页，2024年2月25日，星期天思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？

本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。第23页,共43页，2024年2月25日，星期天按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释101102103104105106第24页,共43页，2024年2月25日，星期天4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基:（2）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。第25页,共43页，2024年2月25日，星期天培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)第26页,共43页，2024年2月25日，星期天

挑选产生明显透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。5、挑选产生透明圈的菌落第27页,共43页，2024年2月25日，星期天刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg／mL的CR溶液，10～15min后倒去CR溶液，加入物质的量浓度为lmol／L的NaCI溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的茵落周围将会出现透明圈。第28页,共43页，2024年2月25日，星期天方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！第29页,共43页，2024年2月25日，星期天方法二：在倒平板时就加入刚果红

配制质量浓度为10mg／mI的CR溶液，灭菌后，按照每200mI培养基加入1mI的比例加入CR溶液，混匀后倒平板，等培养基上长出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。

第30页,共43页，2024年2月25日，星期天这两种方法各有哪些优点与不足？染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。第31页,共43页，2024年2月25日，星期天比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法刚果红染色法第32页,共43页，2024年2月25日，星期天

在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯化培养。6、纯化培养第33页,共43页，2024年2月25日，星期天

1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2.分离的结果是否一致

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。（四）结果分析与评价第34页,共43页，2024年2月25日，星期天

为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_____________实验，纤维素酶的发酵方法有______发酵和______发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的________含量进行定量测定。发酵产纤维素酶

液体

固体

葡萄糖

（五）课题延伸第35页,共43页，2024年2月25日，星期天分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结第36页,共43页，2024年2月25日，星期天D1、下列材料中纤维素含量最高的是()A．杨树B．小麦

C．玉米D．棉花第37页,共43页，2024年2月25日，星期天C2、纤维素酶能够分解()A．纤维素的微生物

B．淀粉的微生物

C．纤维素

D．淀粉第38页,共43页，2024年2月25日，星期天B3、刚果红能与哪项物质