药理实验方法学概述

药理实验方法学概述简介药理学是一门实验性学科，其理论、学说、设想和结论都取决于实验结果，没有实验数据，就没有药理学的知识和内容；没有先进的、科学的实验方法，就没有可靠的实验数据，就没有药理学；药理实验方法是促进药理学迅速发展的前提。第2页,共68页，2024年2月25日，星期天理论教学内容（16学时）药理实验方法概述与药理学有关的实验动物的选择和利用分子生物学方法和体外试验在药理学中的应用毒理试验方法第3页,共68页，2024年2月25日，星期天实验教学内容（32学时）量效关系曲线测定（ED50和LD50测定）动物体内磺胺药浓度测定药物血浆蛋白结合率测定大鼠肝S9制备小鼠骨髓细胞微核试验小鼠精原细胞染色体畸变分析大鼠肝微粒体制备及其酶活性测定小鼠碳廓清试验第4页,共68页，2024年2月25日，星期天第一讲药理实验方法学概述第5页,共68页，2024年2月25日，星期天一、实验药理学与药理学实验实验药理学（experimentalpharmaco-logy）是药理学的重要组成部分，在药理学的发展过程中占有极为重要的地位。是以实验研究为目的研究药物作用及其作用机制的学科，是药理学方向的一门应用性专业课。其任务是培养学生掌握和熟悉实验常用仪器的正确使用、实验标本的制备、条件的控制和指标的选择、实验结果的分析、处理等基本技能。

第6页,共68页，2024年2月25日，星期天药理学：一门实验科学，其发展和进步都离不开实验获得的结果；而药理学理论的形成也离不开实验的验证。药理学实验：以实验为基础，按一定的方案，用相关的实验方法或模型试验，得到实验结果，以说明某一药物的作用特点或作用规律。第7页,共68页，2024年2月25日，星期天目的药理学实验：具体的实践过程，通过药理学实验，实现实验药理学的研究目的，获得药理学的新知识，促进药理学的进步和发展实验药理学：通过探讨药理学实验的特点和规律，使药理学实验符合科学、规范、准确的要求，有效地解决药理学研究中的实际问题，为药理学研究提供合理方法和技术保障第8页,共68页，2024年2月25日，星期天内容药理学实验:

解决具体技术问题，是具体的某种实验方法实验药理学:

研究药理学实验过程中的共性问题，提供药理学实验研究的基本知识第9页,共68页，2024年2月25日，星期天用途

药物（尤其是新药）评价，如作用强度、量-效关系、时-效关系、毒副作用、作用机理等。包括

主要药效研究和一般药理研究第10页,共68页，2024年2月25日，星期天主要药效研究原则用体内、体外两种以上实验方法获得证明，其中一种必须是整体的正常动物或动物病理模型；各项实验均应有空白对照和已知药物对照；实验结果需经统计学处理。应有两种以上剂量及不同的给药方法，溶于水的药物应做静脉注射。第11页,共68页，2024年2月25日，星期天一般药理研究

应用产生主要药效作用的剂量与给药途径，对清醒动物或麻醉动物进行一般药理研究主要研究内容（核心组合实验）中枢神经系统：观察活动情况和行为变化心血管系统：心率、心电图、血压呼吸系统：对呼吸频率和深度的影响第12页,共68页，2024年2月25日，星期天二、药理学实验的常用方法物理学方法化学方法数学方法实验动物学方法细胞生物学和分子生物学方法基础医学和临床医学方法第13页,共68页，2024年2月25日，星期天三、药理实验设计的基本原则重复（replicaton)随机（randonmization)对照（control)

三项统计学原则由实验设计奠基者Fisher提出至今，基本精神未变，但内容有发展第14页,共68页，2024年2月25日，星期天（一）重复重复是实验设计的首要原则精确可靠的实验结果应在相同条件下重复出来能够充分重现的实验，才能称为可靠的实验要有足够的重复数（实验次数或实验例数），才有可能做出正确的结论。第15页,共68页，2024年2月25日，星期天重复原则的含义重复稳定性，或称重现性重复数第16页,共68页，2024年2月25日，星期天减少干扰因素对实验的影响

动物方面品种、年龄、性别、饲养（条件）等仪器方面灵敏度、精确度、操作熟练程度等药物方面批次、纯度、剂量、注射速度等环境方面温度、湿度、气压等气候因素第17页,共68页，2024年2月25日，星期天重复数与重现性的辩证关系

只有足够的重复数才能取得较高的重现性；为达到某一重现性，必须有相应的适当的重复数。第18页,共68页，2024年2月25日，星期天重复数的数量与质量的辩证关系数量是保证重现性的基础质量是保证实验能够重复的重要条件应尽量采用精密准确的实验技术，减少实验误差，保证重复实验在相同条件下进行。第19页,共68页，2024年2月25日，星期天相同条件同时同地实验条件同条件同种（相同种属品系的动物）同批（同一厂家生产的同批号样品）材料条件同病情（病理模型）第20页,共68页，2024年2月25日，星期天实验条件严密性与代表性的辩证关系实验条件控制越严密，个体差异越小，越有利于获得准确的结论；条件控制的过于严密，实验结果的代表性就差，所得结论的适用范围和重现范围会受到限制。∴在重复原则中，存在典型性和代表性或普遍性的关系。第21页,共68页，2024年2月25日，星期天（二）随机实际意义使每个实验对象在接受处理时，有相等的机会，以减少主观因素的影响，减少或避免偏性误差，不随机即有系统误差，显著性检验就无意义。随机不是随便随机必须按随机原则采用随机数字表，以保证实验对象分组的机会相等，随便分组不可能达到每个实验对象机会均等。第22页,共68页，2024年2月25日，星期天绝对随机与均衡随机绝对随机又称完全随机，用于例数较多时优越性较大;均衡随机先将能控制的主要因素均衡分档，再在每一档中随机取出等量动物分配到各组，使较难控制的因素得到随机安排。第23页,共68页，2024年2月25日，星期天（三）对照

对照是比较的基础，没有对照就没有比较和鉴别，就谈不上定量研究自身对照减少个体差异组间对照药理实验中最为常用其他对照正常值对照文献值对照第24页,共68页，2024年2月25日，星期天组间对照

空白对照不给药，不作任何处理实验对照不给药，处理同实验组阳性对照给予同类药物或已知标准品模型对照第25页,共68页，2024年2月25日，星期天阴性对照

不含研究中处理因素的对照组空白对照不给任何处理的对照假处理对照

经同样的麻醉、注射，但不进行关键处理安慰剂避免心理状态对药效的影响第26页,共68页，2024年2月25日，星期天阳性对照药物对照用已肯定疗效的药物作对照，应为阳性结果标准品对照用标准药物或典型药物作为对照，目的是提供对比标准，以评定药物效价弱阳性对照用常规疗法或老药、老疗法、老方案对照第27页,共68页，2024年2月25日，星期天四、实验程序1.实验动物的选择种属差异品系差异性别差异2.给药方法3.实验水平（机体水平）

粗分：整体、离体；细分：分子、（亚）细胞、组织、器官、整体动物等。4.正常动物和模型动物实验5.预防实验和治疗实验6.比较试验第28页,共68页，2024年2月25日，星期天五、药效评价标准1.药效评价的定量方法量-效关系分析为基本分析量反应的量-效关系剂量与效应质反应的量-效关系剂量与药效反应率时反应的量-效关系剂量与潜伏期或持续期时-效关系分析药效经时变化的动态规律构-效关系分析结构与药效药-靶关系分析与酶、受体、蛋白质、载体、膜通道等的关系第29页,共68页，2024年2月25日，星期天2.药物作用强度与量-效关系3.药物作用持续时间与时效关系药物作用时间包括起效时间和持续时间。比较药物作用强度用达到最大作用时的作用强度为指标；比较作用出现时间用达到最大作用的时间为指标；比较作用持续时间用消除速率或实际作用延续时间为指标；用作用-时间曲线下面积作为综合评价指标，既考虑到作用最大值，又考虑到作用持续时间。第30页,共68页，2024年2月25日，星期天六、实验样本数

影响实验样本数的因素药物效果：药效强，例数可相应减少生物差异：个体差异小，标准差小，可少实验技术：实验手段、仪器和设备严格精密，可少统计处理：可提高实验效率两组例数相等时，总例数可适当减少计量比计数资料实验效率高同体实验比分组实验实验效率高特殊的实验设计实验效率高：拉丁方、正交、交叉等，效率高，信息多，优先采用第31页,共68页，2024年2月25日，星期天药理实验的基本例数按统计学规定的P<0.05及P<0.01和药理专业上的实际例数习惯性规定，确定基本例数。小动物10～30例（计量10，计数30）中等动物8～20例大动物5~15例第32页,共68页，2024年2月25日，星期天七、实验剂量的确定安全剂量的探索—由该药与已知药物的效价比值推算—由剂量折算系数法计算第33页,共68页，2024年2月25日，星期天七、实验剂量的确定剂量递增方案：应用开始试用量（ds）后，如未出现疗效，也未出现任何不良反应，则按下述方案递增：对于动物实验，按ds、2ds、3.3ds递增，2～4次可达到预期量，以后均按增长率30％～33％递增。第34页,共68页，2024年2月25日，星期天多剂量实验中剂量间距的确定整体动物实验1:3:9或

1:2:4:8（3或2倍递增），太小，相邻组药效倒置；太大，药效易处于S形曲线平坦处，不利于对比分析离体器官实验1:10:100:1000（10倍递增）计算LD50或ED50的实验要求0％及100％之间有3～6个剂量组，量反应资料取1：0.1～1：0.5的组间比值，质反应资料取1：0.6～1：0.85的组间比值第35页,共68页，2024年2月25日，星期天

按体表面积计算

A=K×(W2/3/10000)A：体表面积（m2）

W：体重(g)K：体表面积系数小鼠大鼠豚鼠家兔犬猴人K9.19.19.810.111.211.810.5人与动物及各类动物间药物剂量的换算第36页,共68页，2024年2月25日，星期天如：某药大鼠剂量为250mg/kg，问犬的给药剂量？（假设一般实验大鼠0.2kg，实验犬10kg）①算大鼠体表面积：A=0.031m2②将mg/kg剂量换算为mg/m2剂量：（250mg/kg×0.2kg）/0.031m2=1608mg/m2③算犬体表面积：A=0.5198m2④算犬给药剂量：1608mg/m2×0.5198m2/10kg=84mg/kg第37页,共68页，2024年2月25日，星期天

按体型系数换算

dA=dB×RA/RB×（wA/wB）1/3dA和dB分别是A、B两种动物的每kg体重剂量（mg/kg)RA和RB分别是A、B两种动物的体型系数

wA和wB分别是A、B两种动物的体重小鼠大鼠豚鼠兔猫猴犬人R5990999382111104100第38页,共68页，2024年2月25日，星期天八、实验的稳定性和灵敏度

及其实验误差的控制第39页,共68页，2024年2月25日，星期天实验的稳定性影响因素样本的代表性如年龄与体重分组上的差异体重、年龄、健康状况等不同，分组不均匀，反应性差别明显实验条件时间、温度、操作误差等实验顺序给药顺序、交叉顺序第40页,共68页，2024年2月25日，星期天表示方法

用变异系数（CV）或相对标准差（RSD）表示。CV越小，实验波动越小，稳定性越好。

CV＜0.05稳定性好CV＞0.3波动较大，应改进实验方法或更换测量指标。第41页,共68页，2024年2月25日，星期天提高稳定性的基本原则从实践和理论上认识受试药物对所用实验动物的生物反应差异性的规律：

实验的专属性即反应指标在多大程度上体现药物的作用强度

研究剂量-效应关系，应该选择剂量与效应的直线范围宽、剂量增减一定程度后效应增减幅度较明显、相同剂量各次反应之间差异较小的实验方法、模型和指标；第42页,共68页，2024年2月25日，星期天调整样本数

生物差异大的实验，用较多的动物，以提高实验的准确性；加强实验条件的控制动物条件：年龄、体重、性别和窝别一致实验设计方法：合适，以减少实验误差第43页,共68页，2024年2月25日，星期天实验方法的反应类型量反应或直接测定最小数量，信息量大质反应信息量小统计方法的应用删除、舍弃由于不正常操作或某些难以预测的因素的影响重复实验、合并计算等手段提高实验结果的正确性第44页,共68页，2024年2月25日，星期天实验的灵敏性意义：考察药效方法或模型对药物剂量变化的敏感程度的一项指标。影响因素：模型或方法的选择实验动物年龄、性别、健康状况实验设计量效曲线16％～84％表示方法：因变系数第45页,共68页，2024年2月25日，星期天因变系数因变系数即回归系数或回归线斜度第46页,共68页，2024年2月25日，星期天实验误差控制误差：

指非设计因素带来的使标准差增大的所有差异认识误差来源从而控制误差第47页,共68页，2024年2月25日，星期天误差来源1.抽样误差

存在于任何实验，是实验中的重要误差。

控制方法：一定数量的样本数重复实验随机化使样本具有代表性第48页,共68页，2024年2月25日，星期天2.非均匀性误差

主要由样本代表性误差所造成，因样本不是来源于均匀总体，仅在某一范围内抽样。

控制方法：分层随机法分组，既可得到总平均值，又可得到各层平均值。3.分配误差

发生在将样本个体分配在一定空间及不同性质的组内。

控制方法：随机化是唯一消除的方法。第49页,共68页，2024年2月25日，星期天4.条件误差

影响因素：时间、温度、湿度、气压、仪器的稳定性和灵敏度、操作者技术水平和熟练程度、实验动物的状况等。

控制方法：对照、随机5.顺序误差

是特殊形式的条件误差，发生在实验进行时。

控制方法：在任何顺序中均应采用随机化，无法随机时，采用对照与实验个体交叉设计。第50页,共68页，2024年2月25日，星期天6.估计误差

是主观误差，由实验者的主观愿望所造成，搜集材料、测定数据偏向有利实验结果的方向控制方法：实验者必须有实事求是、严谨的工作作风；尽可能采用现代化、自动化的实验仪器，让仪器作出准确的纪录。第51页,共68页，2024年2月25日，星期天九、实验数据的整理与处理第52页,共68页，2024年2月25日，星期天1.

读数

数据计算和取值遵循有效数字法则及数字修约规则。第53页,共68页，2024年2月25日，星期天精密度：仪表的最小刻度称为仪器的精密度。读数时，由仪表最小刻度值向下估读一位，数据最末位允许上下一个单位的误差。存疑数字：指最后一位估读的数字有效数字：数字中决定数量大小的有意义的数字，即由数字左侧第一个非零数字开始直到最后包括0在内的数字。与仪器的灵敏度有关，反映数据的测量误差第54页,共68页，2024年2月25日，星期天有效数字与仪器精密度有效数字：仪器最小刻度是准确的，前面的准确数字和末位的存疑数字统称有效数字。要求：

根据仪器实际具有的精密度正确读数、正确记录实验结果的有效数字，多读和少读均是错误的。

计算过程中允许多保留一位有效数字，但结果必须按规定修约。第55页,共68页，2024年2月25日，星期天例如：称取小鼠的体重是21.4g，表示体重的真值在21.35~21.45g之间，其中，21g是准确的，4是估计的，3个数字均有意义，因此该数据的有效数字是3位。第56页,共68页，2024年2月25日，星期天2.有效数字与误差传递称取指用分析天平称量，精密度为±0.1g精密称取或准确称取指用微量天平称取，其精密度为±0.0001g第57页,共68页，2024年2月25日，星期天“0”在数字中的双重性数据左侧的0起定位作用，仅表示小数点位数，不是有效数字，如0.0214数据右侧的0，即数字末尾的0是有效数字，不能舍去，如21.40在仪器中，数字末尾的0表示仪器的精密度，且有±1个单位的误差。如0.0618与0.06180，前者为0.0001，后者为0.00001。第58页,共68页，2024年2月25日，星期天误差传递规律——加减计算

得数的最大绝对误差是各实测值绝对误差之和。加减得数的小数位数等于或小于实测值中最少的小数位数如8.34＋0.0356－1.100＝7.2756

最大绝对误差是0.01+0.0001+0.001＝0.0111

取舍为7.27567.28第59页,共68页，2024年2月25日，星期天误差传递规律——乘除计算积商的最大相对误差是各实测值相对误差之和。乘除得数的有效位数等于或小于实测值中最少的有效位数。第60页,共68页，2024年2月25日，星期天如药物800.0mg,药液容量50.00mL，动物体重19.5g(0.0195kg)，注射用量0.68mL，则：用药量为（800.0mg/50.00mL)×(0.68mL/0.0195kg)=557.95mg/kg最大相对误差为0.1/800.0+0.01/50.00+0.01/0.68+0.0001/0.0195=0.02016=2.016%最大误差557.95×2.016％＝11.25mg/kg用药剂量应为0.56g/kg不能写为560mg/kg，因560有三位有效数字第61页,共68页，2024年2月25日，星期天误差传递规律——乘方开方计算乘方开方计算值的有效位数与原有效位数相同第62页,共68页，2024年2月25日，星期天误差传递规律——对数反对数计算对数反对数计算值的有效位数与实测值相同，但对数的整数部分（首数）不算有效数字，不参与计算即对数尾数的有效数字与实测值相同