杜平华-药典附录无菌检查和微生物限度检查方法增修定内容省公开课金奖全国赛课一等奖微课获奖课件

药典附录无菌检验和微生物

程度检验方法增修定内容杜平华1/87

起草指导思想

一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、环境友好型社会要求；落实科学监管理念，着力处理发展中问题。二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与结果；坚持自主与创新；主动推进药品标准化战略，提升我国药品标准总体水平，着力提升《中国药典》在国际社会中地位和作用，提升综合竞争力，促进医药产业健康发展，为构建社会主义友好社会作出贡献。2/87

年版无菌检验法增修订内容3/87

一、深入确定了无菌检验法定义：无菌检验法系用于检验要求无菌药品、医疗器具、原料、辅料、及其它品种是否无菌一个方法。

二、深入明确了无菌检验保障

1、检验全过程必须严格恪守无菌操作，预防再污染

，但采取办法不得影响微生物生长。2、无菌检验要进行环境检测增加了日常检验还需进行环境检测。2、无菌检验人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。4/87

三、培养基增修订内容⒈删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基使用范围(用于培养好氧菌、厌氧菌及用于培养真菌)

⒉删去选择性培养基使用表面活性剂种类对氨基苯甲酸、聚山梨酯-80等。理由经验证试验选择适宜中和剂、灭活剂和表面活性剂

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培养基适用性检验增修订内容

3、培养基灵敏度试验

⑴删除菌悬液制备中黑曲霉菌悬液制备“（用管口带有薄无菌棉花或纱布能过滤菌丝无菌毛细吸管）”修改为“用适宜方法吸出孢子悬液”。

⑵增加在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加入0.05％v/v）聚山梨酯80。

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四、试验稀释液、冲洗液增修订为

⒈

增加依据供试品特征，可选取其它经验证过适宜溶液作为稀释液、冲洗液。⒉试验中使用中和剂、灭活剂和表面活性剂除证实其有效性外还应证实对污染微生物无影响修改为无毒性。

7/87五、方法验证试验增修订内容⒈试验菌株

删除铜绿假单胞菌增加大肠埃希菌及大肠埃希菌菌液制备(同金黄色葡萄球菌)。⒉薄膜过滤法供试品用量将要求量供试品按薄膜过滤法过滤

修改为取每种培养基要求接种供试品总量。

8/87六、供试品无菌检验增修订内容⒈检验量

直接接种法除另有要求外，每份培养基接种供试品量按表2、表3要求删除采取直接接种法时要求。⒉阴性对照

无菌试验中若使用表面活性剂等应证实其有效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。

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⒊薄膜过滤法

①增加了抗生素供试品滤膜选择指导应选择低吸附滤器及滤膜。②若需要冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量普通为100ml，且冲洗量不宜过大修改为总冲洗量不得超出1000ml。

⑴水溶液供试品含抑菌成份需用适量冲洗液冲洗膜修改为所用冲洗量、冲洗方法同方法验证试验.

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⑵装有药品注射器供试品取要求量，删去装上无菌针头….修改为排出注射器中内容物至无菌容器中，若需要可吸入稀释液或标签所表示溶剂溶解，或非水溶性制剂供试品项下方法操作。

⑶无菌气雾剂供试品供试液制备将供试品置冰室修改为置最少-20℃冷冻室约1小时。11/87

⒋直接接种法删除β－内酰胺类或磺氨类供试品。

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表1、表2、表3增修订表1（第3列）接种每种培养基改为所需最少检验数量

表2

（表题）上市抽验样品（液体制剂）最少检验数量修改为液体制剂最少检验量及上市抽验样品最少检验数量第二列每支样品接入每管培养基最少样品量修改为每支供试品接入每管培养基最少样品量第三列最少检验数量（瓶或支）≤1全量２0①

修改为供试品最少检验数量（瓶或支）１0①

注①每种培养基各接种１０支供试品修改为若供试品每个容器内装量不够接种两种培养基，那么表中最少检验数量加倍。13/87

表3（表题）将上市抽验样品（固体制剂）最少检验量

修改为固体制剂最少检验量及上市抽验样品最少检验数量”第三列最少检验数量、≤1全量２0①

修改为供试品最少检验数量（瓶或支）

１0①

注①每种培养基接种１０支培养基修改为若供试品每个容器内装量不够接种两种培养基，那么表中最少检验数量加倍。14/87

微生物程度检验增修定内容15/87

修改内容

1、培养条件控制菌培养温度35℃～37℃修改为30℃～35℃(细菌、控制菌培养温度相同)。

修改理由此温度适于全部中温菌生长，一些高温菌在该温度下也能够生长。16/87

增修订内容

2、结果汇报特殊品种能够最小包装单位汇报特殊品种包含∶药典要求微量包装药品检验量能够酌减。还有一些珍贵药品也应考虑检验量。17/873、检验量增修订内容

⑴中药膜剂检验量50cm2

修改为100cm2

。

⑵沙门菌检验量修改为检验量为20g或20ml并注明（其中10g用于阳性对照）。18/87

4、供试液制备增修订内容

⑴供试品检验时使用表面活性剂应证实其对微生物生长和存活无影响修改为无毒性。⑵供试液制备若需加温时，可采取其他经验证方法，但应均匀加热，且温度不应超过45℃。19/87

⑶新增贴剂供试液制备

供试液制备

⑴经验证方法制备成供试液在无菌环境进行。⑵防止粘贴面粘合在一起。⑶置于含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀释剂中，制成供试液。⑷充分振摇。⑸也可采取以其它适宜方法制备成供试液。20/87⑷具抑菌活性供试品增修订内容

删除应消除供试液抑菌活性修改为当供试品含有抑菌活性时，应尽可能选择操作简便、快速方法，应防止损伤供试品中污染微生物。在供试品溶液性状允许情况下，应尽可能选取薄膜过滤法。21/87

①离心沉淀集菌法

两次离心修改为一次离心；500转/分离心，不超出3分钟，取全部上清液用于检查。

影响原因

供试品污染菌特征

适用范围

⒈仅使用于微生物程度检验供试液制备。⒉尽可能防止使用，不可使用快速离心。

22/87细菌、霉菌及酵母菌计数增修订内容

⒈新增计数培养基适用性检验

⑴菌种

大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕

白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕

黑曲霉（Aspergillusniger）〔CMCC（F）98003〕

23/87①

增加了菌悬液制备及保留条件。菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使用，若保留在2～8℃能够在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保留在2～8℃，在验证过贮存期内使用，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，按要求条件培养计数，同时用对应对照培养基替换被检培养基进行上述试验。

②增加了对照培养。24/87

2.新增常见干扰物中和剂和灭活方法

参见表1常见干扰物中和剂或灭活方法

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6、供试品检验增修订内容

26/87

⑴平皿法删去采取平皿法进行菌数测定时，连续2～3个稀释级供试液。

修改为按计数方法验证试验确认程序进行供试液制备。

27/87

⑵培养时间修改内容除另有要求外，细菌培养48小时改为3天，霉菌、酵母菌培养72小时改为5天，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并汇报。28/87

菌数汇报规则增修订内容

⒈若同稀释级两个平板菌落平均数大于15，则两个平板菌落数不能相差1倍或以上。⒉细菌、酵母菌和霉菌平均菌落数在30～300、30～100之间稀释级修改为选取菌落数小于300cfu和100cfu稀释级作为菌数汇报依据。29/87

⑶薄膜过滤法增修订内容

新增内容采取其它直径滤膜，冲洗量应对应进行调整（如使用膜直径增大冲洗液量也应对应增加，可确保冲洗液覆盖整个滤膜）。

删去每片滤膜总过滤量不宜过大，修改为总冲洗量不得超出1000ml。30/87

7、控制菌检验增修订

⑴增加控制菌检验用培养基适用性检验；

检验项目包含促生长、抑制及指示能力检验参考表2

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⑵新增培养基适用性检验方法①液体培养基促生长能力检验。②固体培养基促生长能力检验。③培养基抑制能力检验。④液体培养基指示能力检验。⑤固体培养基指示能力检验。

试验结果与对照培养基比较32/87控制菌检验用培养基适用性检验控制菌检验用培养基促生长、抑制及指示能力检验控制菌检验培养基特征试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌

MUG促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝或麦康凯促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝或麦康凯促生长能力+指示能力大肠埃希菌

33/87沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿促生长能力乙型付伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂培养基促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型付伤寒沙门菌铜绿假单胆盐乳糖促生长能力铜绿假单胞菌胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三促生长能力铜绿假单胞菌甲铵琼脂抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡亚碲酸盐肉汤促生长能力金黄色葡萄球菌萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌或甘露醇盐琼脂抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌吐温80玉米琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌34/87⑶控制菌检验法增修订内容

①疑似致病菌确实证微生物控制菌检验中没有要求深入确证疑似致病菌方法。选择已被认可菌种判定方法。如《伯杰氏细菌判定手》。

②控制菌检验方法验证删去阴性菌对照组。

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③大肠菌群检验用胆盐乳糖培养基改为乳糖胆盐。

④改梭菌检验用庖肉培养基为梭菌增菌培养基。⑤改梭菌培养时间72～96小时为48小时。

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增加了白色念珠菌检验方法

增菌培养沙氏葡萄糖肉汤培养基。分离培养划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。37/87

判定试验

经典菌落⒈沙氏葡萄糖琼脂培养基菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。⒉念珠菌显色培养基

菌落呈绿色或翠绿色菌落生长。

38/87⒋确认试验取1%吐温80-玉米琼脂培养基培养物进行染色，镜检及芽管试验。

结果判断非革兰阳性菌，显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管判未检出白色念珠菌。39/87

新增微生物程度检验法指导标准一、抑菌剂效力检验法指导标准二、药品微生物检验替换方法验证指导标准三、微生物程度检验法应用指导标准四、药品微生物试验室规范指导标准40/87一、抑菌剂效力检验法指导标准⒈指导标准目标⑴是为测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂活性，以评价最终产品抑菌效力及生产企业在制剂研发阶段抑菌剂确实定提供指导。⑵为预防药品因为微生物污染而引发变质，对服用者造成不良反应，在药品生产过程中加入一定剂量抑菌剂。⑶抑菌剂不能用于替换药品生产GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染唯一路径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前生物负载伎俩。41/87⒉使用范围及标准

⑴使用范围假如药品本身不含有充分抗菌活性，应依据制剂特征添加适宜抑菌剂，以预防制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生微生物污染和繁殖，对患者造成伤害。42/87

⑵使用标准

全部抑菌剂都含有一定毒性，添加抑菌剂时应注意以下标准:

①抑菌剂用量应为最低有效量。②具有抗菌活性制剂应确认其抗菌效力。43/87

③应验证最终容器中抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。④本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开成品制剂。44/87

⒊抑菌剂抑菌效力测定

⑴供试品分类

分为四类，但对于一些抗酸性制剂和含活生物制剂应考虑会降低有益菌生物活性。见表145/87表1产品分类

类别药品

1类注射剂、其它非肠道制剂，包含乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂

2类局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜乳剂

3类口服非固体制剂（非抗酸制剂）

4类非固体抗酸制剂46/87

⑵培养基①培养基制备胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基胰酪胨大豆肉汤培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基

②培养基适用性检验同控制菌培养基适用性检验

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⑶抑菌剂效力测定方法

①菌种菌液制备

菌种

同培养基适用性检验，制剂中常见污染微生物也可作为试验菌。

菌液制备

制成每1ml含菌数约为108cfu菌悬液。

②供试品接种影响原因给予指导

容器材质、形状、体积、封口方式及容器PH等分别给予了指导。

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③接种菌量接种菌液体积不得超出供试品体积0.5%～1%。

④放置20～25℃，避光贮存，贮存温度改变应尽可能控制在最小范围，并预防被污染。49/87

⑷存活菌数测定

采取经验证方法进行试验，计算1ml(g)供试品各试验菌所得菌数及各间隔时间菌数，并换算成lg值。50/87

⑸结果判断结果符合表3要求，可判断该产品抑菌效力符合要求。51/87

表3抑菌剂抑菌效力判断标准

1类供试品

细菌7天菌数下降不少于1.0lg，14天菌数下降不少于

3.0lg,14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，7、14、28天菌数均不增加。

2类供试品细菌14天菌数下降不少于2.0lg，14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。

3类供试品细菌14天菌数下降不少于1.0lg，14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。

4类供试品细菌，真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。

注：1、表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加数量不超出0.5lg。

2、0时菌数(初试值)供试品加入试验菌，摇匀，马上取样检查，培养，计数，为0时菌数。52/87二、药品微生物检验替换方法验证指导标准⒈目标

⑴是为所采取试验方法能否替换药典要求方法用于药品微生物检验提供指导。⑵在控制药品微生物质量中，需要采取替换方法时，应进行方法验证，确认其应用效果优于或等同于药典方法。53/87

⒉微生物检验类型及验证参数

药品微生物检验方法主要分两种类型

定性试验定量试验⒊生物试验特殊性抽样误差操作误差稀释误差培养误差计量误差计数误差药品质量标准分析方法验证指导标准不完全宜于微生物替换方法验证。54/87

表1、不一样微生物检验类型验证参数表参数定性检验定量检验准确度－＋精密度－＋专属性＋＋检测限＋－定量限－＋线性－＋范围－＋耐用性＋＋重现性＋＋注：＋表示需要验证参数－表示不需要验证参数逐项按替换方法验证要求进行验证和评价方便操作者了解方法关键操作点55/87⒋替换方法验证普通要求

⑴适用性验证前，对替换方法有一个全方面了解；

由替换方法研发者提供，或由方法使用者完成。⑵验证应最少使用2个批号样品，每批样品应平行进行最少3次独立试验。⑶在开展各参数验证时，除要求菌株外，还应依据替换方法及样品特点增加对应菌株。

56/87三、药品微生物程度检验法应用指导标准目标为更加好应用微生物程度检验法及程度标准合理执行提供指导。

用途用于判断非要求灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典要求，也可用于指导制剂、原料、辅料微生物质量标准制订，及指导生产过程中间产品微生物质量监控。本指导标准将对标准和方法中特定内容及标准应用做深入说明。57/87

1.微生物程度检验过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，应对其用量、有效性、无毒性进行确认，无毒性确认，试验菌株应包含产品中可能污染微生物。58/87

2.检验方法选择

供试液制备应尽可能选择微生物程度检验法中操作简便、快速方法，且应防止损伤供试品中污染微生物。对于抑菌作用较强供试品，在供试品溶液性状允许情况下，应尽可能选取薄膜过滤法进行试验。59/873.供试液制备

本指导标准对离心沉淀法使用范围、方法及对检验结果影响原因进行了分析和指导

4.验证试验存在问题及处理方法自药典收载方法验证以来在实施过程中存在一些详细问题，对这些存在问题进行了指导；进行验证试验时，因没有适宜方法消除供试品中抑菌作用而造成微生物回收失败。60/87

⑴处理方法

①应采取能使微生物生长更高稀释级供试液进行方法验证试验。②若采取允许最高稀释级供试液进行验证试验还存在一株或多株试验菌回收率达不到要求。

处理方法应选择回收情况最靠近要求方法进行供试品检测。61/87③在以上情况下，生产单位或研制单位应进行全方面风险评定以确保检验方法可靠性，从而确保产品质量。

62/87５.控制菌确实证没有要求深入确证疑似致病菌方法。仅要求若供试品检出疑似致病菌，确证方法应选择已被认可菌种判定方法。63/87⒍微生物程度标准

该指导标准对标准执行中存在问题进行了分析和指导；

⑴明确了微生物程度标准使用范围

⑵标准执行①必检项目②原则性要求（丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂），应对其被微生物污染风险进行评定。

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⑶用于手术、烧伤及严重创伤局部给药制剂应符合无菌检验法要求。

⑷用于创伤程度难以判断局部给药制剂，若没有证据证实药品不存在安全性风险则应符合无菌检验法要求。⑸眼用制剂应符合无菌检验法要求。65/87

⑹含动物类原药材粉口服中药制剂要求不得检出沙门菌。其中动物类原药材粉是指除蜂蜜、王浆、动物角、阿胶外全部动物类原药材粉，如牡蛎、珍珠等贝类，海蜇、冬虫夏草、人工牛黄等。

⑺制订合理、安全和严格微生物程度标准

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四、药品微生物试验室规范指导标准

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⒈目标该指导标准用于指导药品微生物检验试验室质量控制。

⒉药品微生物检验对象具特殊性；活生物、分布不均匀、重现性差

必须使用经验证检测方法并严格按照药品微生物试验室规范要求进行试验。68/87⒊药品微生物试验室规范包含以下几个方面人员、培养基、菌种、试验室布局和运行、设备、文件、试验统计、结果判断等。⑴人员从事药品微生物试验工作人员应具备微生物学或相近专业知识教育背景

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①检验人员和管理人员培训

进行岗前培训检验人员技能培训熟悉相关检测

方法、程序、检测目标和结果评价。70/87

管理人员

①其专业技能和经验水平应与他们职责范围相符。不停接收系统教育与职责范围相关培训。

②客观评定检验人员能力，必要时对其进行再培训并重新评定。

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⒉培养基

培养基是微生物试验基础，直接影响微生物试验结果。适宜培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基保证。

该指导标准对培养基制备、储存、灭菌及质量控制进行了指导。72/87

⒊菌种

试验室菌种处理和保藏程序应标准化，⑴使尽可