肉制品中大肠菌群的检验（肉制品检测）

食品中大肠菌群检验GB4789.3一2016的解读GB4789.3一2016与2010版相比内容的变化一GB4789.3一2016适用范围和检验原理二MPN计数法中所用的培养基的成分的用途说明三目录

平板计数法中所用的培养基的成分的用途说明四一、GB4789.3一2016与2010版相比内容的变化本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下:

1.增加了检验原理;2.修改了适用范围;3.修改了典型菌落的形态描述;4.修改了第二法平板菌落数的选择;5.修改了第二法证实试验;6.修改了第二法平板计数的报告。食品中大肠菌群检验国标的解读二、GB4789.3一2016适用范围和检验原理1.适用范围本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。2.检验原理2.1MPN法最可能数Mostprobablenumber；MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。食品中大肠菌群检验国标的解读二、GB4789.3一2016适用范围和检验原理MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。MPN值只是样品中活菌密度的估算值，并不是样品中活菌菌落数的真值。MPN检索表是国际标准化组织ISO、美国食品药品管理局FDA、美国分析化学家协会AOAC、美国农业部食品安全与监测服务部USDA/FSIS和北欧等组织制定的标准所通用的。食品中大肠菌群检验国标的解读二、GB4789.3一2016适用范围和检验原理2.2平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。平板计数法相对于MPN法来说，检验结果更精确。适合用于污染比较严重的样品，但对于污染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。食品中大肠菌群检验国标的解读三、MPN计数法中所用的培养基的成分的用途说明食品中大肠菌群检验国标的解读

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤:胰蛋白胨或胰酪胨…提供碳源和氮源满足细菌生长的需求氯化钠…………………可维持均衡的渗透压乳糖……大肠菌群可发酵的糖类磷酸氢二钾（K2HPO4）…………缓冲剂磷酸二氢钾（KH2PO4）…………缓冲剂月桂基硫酸钠…………抑制非大肠菌群细菌的生长蒸馏水……溶剂

乳糖有利于大肠菌群的生长繁殖，并有助于鉴别大肠菌群和肠道致病菌。LST肉汤是国际上通用的培养基。三、MPN计数法中所用的培养基的成分的用途说明食品中大肠菌群检验国标的解读煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 蛋白胨……提供碳源和氮源满足细菌生长的需求乳糖……………大肠菌群可发酵的糖类牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液…………抑制非肠杆菌科细菌0.1%煌绿水溶液………………抑制非肠杆菌科细菌 蒸馏水………………溶剂四、平板计数法中所用的培养基的成分的用途说明结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA）:蛋白胨和酵母粉…提供碳氮源和微量元素乳糖…………………大肠菌群可发酵的糖类氯化钠………………可维持均衡的渗透压；胆盐…………………抑制革兰氏阳性菌，尤其是粪链球菌；结晶紫………………抑制革兰氏阳性菌，pH指示剂中性红………………pH指示剂。食品中大肠菌群检验国标的解读

大肠菌群检测的意义及常用方法

大肠菌群的定义、形态特征和培养特性一

食品中大肠菌群检验的意义（以肉品为例）二

食品中大肠菌群检测常用的方法三目录页

大肠菌群的定义、形态特征和培养特性一1.大肠菌群的定义2.大肠菌群的形态特征3.大肠菌群的培养特性大肠菌群的定义大肠菌群检测的意义及常用的方法

是指一群在32～37℃下24hr内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的Ⅲ亚属细菌组成。

主要来源于人和温血动物的粪便，广泛分布于自然环境中。

大肠菌群的形态特征大肠菌群检测的意义及常用的方法

此菌（如下图所示）为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。大肠菌群的培养特性大肠菌群检测的意义及常用的方法

大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46℃。在血琼脂平板上，有些菌株产生β型溶血。在鉴别性或选择性培养基上形成有颜色、直径2～3mm的光滑型菌落。生化反应：大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。二、食品中大肠菌群检验的意义（以肉品为例）大肠菌群检测的意义及常用的方法1.大肠菌群在肉和肉制品中检测的意义

大肠菌群作为粪便污染的指标菌，来评价肉和肉制品中是否受到粪便的污染。大肠菌群计数的高低，直接反映了肉和肉制品受粪便污染的程度。大肠菌群计数的高低，可间接表示有无肠道致病菌污染的可能，进而推断肉和肉制品对人体健康是否具有潜在的危险性。肉中含有丰富的营养物质，肉腐败的原因主要是由微生物作用引起变化的结果。肉的腐败过程是微生物将蛋白质分解成蛋白胨、多肽、氨基酸，进一步再分解成氨、硫化氢、酚、吲哚、粪臭素、胺及二氧化碳等的过程，这些腐败产物具有浓厚的臭味，对人体健康有很大的危害。

三、食品中大肠菌群检测常用的方法大肠菌群检测的意义及常用的方法第一法：MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。第二法：平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的典型菌落（如右边图所示)挑取适量的这样的典型菌落进行证实实验，由证实实验的结果来最终确定样品中大肠菌群的数量。三、食品中大肠菌群检测常用的方法大肠菌群检测的意义及常用的方法第三法：Petrifilm测试片法（快速检测法）PetrifilmTM大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB培养基，冷水可溶性凝胶和TTC指示剂，可增强菌落计数效果。表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后计数红点周围有气泡的菌落为大肠菌群数。第一法：大肠菌群MPN计数法

样品的采集和处理一设备和材料二培养基和试剂三目录页

大肠菌群MPN计数检样程序四

大肠菌群MPN计数检样操作步骤五

一1.采样原则和采样方案2.采样用品3.样品的采取和送检4.检样的处理

样品的采集和处理大肠菌群MPN计数法一、样品的采集和处理1.采样原则1.1样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。1.2采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。2.采样方案2.1根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。2.2采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值,三级采样方案设有n、c、m和M值。一、样品的采集和处理2.3采样方案的解释说明n:同一批次产品应采集的样品件数;c:最大可允许超出m值的样品数;m:微生物指标可接受水平限量值(三级采样方案)或最高安全限量值(二级采样方案);M:微生物指标的最高安全限量值。注1:按照二级采样方案设定的指标,在n个样品中,允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。注2:按照三级采样方案设定的指标,在n个样品中,允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值;允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间;不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。大肠菌群MPN计数法

一、样品的采集和处理

例如:n=5,c=2,m=100CFU/g,M=1000CFU/g。含义是从一批产品中采集5个样品,若5个样品的检验结果均小于或等于m值(≤100CFU/g),则这种情况是允许的;若≤2个样品的结果(X)位于m值和M值之间(100CFU/g<X≤1000CFU/g)，则这种情况也是允许的;若有3个及以上样品的检验结果位于m值和M值之间,则这种情况是不允许的；若有任一样品的检验结果大于M值(>1000CFU/g)，则这种情况也是不允许的。大肠菌群MPN计数法大肠菌群MPN计数法一、样品的采集和处理2.4各类食品的采样方案按食品安全相关标准的规定执行。2.5食品安全事故中食品样品的采集2.5.1由批量生产加工的食品污染导致的食品安全事故,食品样品的采集和判定原则按2.3和2.4执行。重点采集同批次食品样品。2.5.2由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食品安全事故,重点采集现场剩余食品样品，以满足食品安全事故病因判定和病原确证的要求。2.采样用品采样箱、

灭菌采样杯、灭菌塑料袋、有盖搪瓷盘、灭菌刀、剪子、镊子、灭菌带塞广口瓶、灭菌棉签、温度计、编号牌（或蜡笔和纸）大肠菌群MPN计数法一、样品的采集和处理大肠菌群MPN计数法3.样品的采取和送检3.1生肉及脏器的检样如是屠宰场宰后的畜肉，可于开腔后，用无菌刀采取两腿内侧肌肉各250g(或劈半后采取两侧背部最长肌肉各250g)，如是冷藏或销售的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位的肌肉250g/只（头），检样采取后放入无菌容器内，立即送检；如果条件不许可时，最好不超过3h。送检时应冷藏，不得加入任何防腐剂。检样送往化验室应立即检验或放置冰箱暂存。一、样品的采集和处理大肠菌群MPN计数法3.2禽类（包括家禽和野禽）

鲜、冻家禽采取整只，放入无菌容器内。带毛野禽可放清洁容器内，立即送检。其他处理要求同3.1。3.3各类熟肉制品诸如酱卤肉、方圆腿、熟灌肠、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取250g,熟禽采取整只，均放入无菌容器内，立即送检。其他处理同3.1。一、样品的采集和处理大肠菌群MPN计数法3.4生灌肠（腊肠、香肠）采取整根、整只，小型的可采用数根、数只，其总量不少于250g4.检样的处理4.1鲜肉检样的处理先将检样进行表面消毒（在沸水内烫3~5s，或灼烧消毒），再用无菌剪子取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加入灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1:10稀释液。或用均质器以8000~10000r/min，均质1min，做成1:10稀释液。一、样品的采集和处理大肠菌群MPN计数法4.2鲜、冻家禽检样的处理

先将检样进行表面消毒，再用无菌剪子取检样深层肌肉25g（一般可从胸部或腿部剪取）。其他处理同生肉。带毛野禽去毛后，同家禽检样处理。4.3各类熟肉制品检样处理直接切取或称取25g,其他处理同生肉。4.4腊肠、香肠等生灌肠检样处理先对生灌肠表面进行消毒，用灭菌剪子剪取内容物25g。其他处理同生肉。一、样品的采集和处理二、设备和材料大肠菌群MPN计数法除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、

均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、天平、菌落计数器、pH计或pH比色管或精密pH试纸等。三、培养基和试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、

1mol/L盐酸（HCI)。

大肠菌群MPN计数法

LST不产气（－）

小导管里无气泡将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤

LST产气（+）四、大肠菌群MPN计数检样程序

1.样品的稀释1.1固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。1.2液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1:10的样品匀液。1.3样品匀液的pH应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。五、大肠菌群MPN计数检样操作步骤

1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。1.5根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。2.初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤)。五、大肠菌群MPN计数检样操作步骤

接种完毕后，将其放入培养箱，36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。3.复发酵试验(证实试验)用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。4.大肠菌群最可能数(MPN)的报告按3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN表(见表1),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。五、大肠菌群MPN计数检样操作步骤

表1大肠菌群最可能数（MPN）检索表五、大肠菌群MPN计数检样操作步骤

注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。

大肠菌群平板计数法

样品的采集和处理一设备和材料二培养基和试剂三目录页

大肠菌群平板计数检样程序四

大肠菌群平板计数检样操作步骤五

一、样品的采集和处理1.样品的采样原则和采样方案样品的采样原则和采样方案和大肠菌群MPN计数法一样，都按照国家食品微生物学检验总则GB4789.1—2016中的相关规定去实施。2.样品的采集和处理样品的采集和处理方式与大肠菌群MPN计数法一样，都按照国家食品微生物学检验肉与肉制品检验GB/T4789.17—2003中的相关规定去实施。大肠菌群平板计数法

二、设备和材料大肠菌群平板计数法除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、

均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、天平、菌落计数器、无菌培养皿、菌落计数器、pH计或pH比色管或精密pH试纸等。

三、培养基和试剂大肠菌群平板计数法

煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA)无菌磷酸盐缓冲液无菌生理盐水1mol/LNaOH溶液1mol/LHCl溶液

36℃±1℃培养18h~24h选择15~150平板计数典型和可疑菌落挑选10个典型菌落接种到BGLB典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，直径为0.5mm四、大肠菌群