生物工程技术基础

第五章生物工程技术基础第一节基因工程

第二节细胞工程、酶工程和发酵工程

第三节现代生物技术的特点

第四节生物技术的一般应用

第五节现代生物技术的军事应用

思考题上一页

下一页返回1生物工程技术基础5/9/2024第一节基因工程一、基因工程的内容

1基因工程概述

2目的基因的获得

3基因工程的载体

4重组DNA分子的构建

5重组DNA分子的导入

二、蛋白质工程下一页上一页返回2生物工程技术基础5/9/2024

1基因工程概述

基因工程是指按照人们的需要和设计，在体外将提取或者合成的目的基因与载体连接成为重组DNA分子，再将其导入受体细胞，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物新的遗传性状。基因工程的核心技术是DNA重组技术。基因工程的主要步骤包括：①从生物基因组中，经过限制性核酸内切酶消化或PCR扩增等方法，分离带有目的基因的DNA片段；②在体外，用DNA连接将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制的载体上；③利用细胞转化等手段将重组DNA分子导入受体细胞，以扩增DNA分子或使其整合到受体细胞的染色体上；④筛选和鉴定出获得重组DNA的受体细胞克隆。如果需要表达基因产物，还需要继续完成以下两个步骤：⑤从筛选出来的受体细胞克隆中分离已经扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；⑥将目的基因克隆到表达载体，导入受体细胞，使之表达出人类所需要的物质。

下一页上一页返回3生物工程技术基础5/9/20242目的基因的获得(1)化学合成法(2)鸟枪法(3)反转录(4)PCR下一页上一页返回4生物工程技术基础5/9/20243基因工程的载体目的基因片段需连接到合适的载体中，才能被转入受体细胞随之繁殖而复制。载体是目的基因进入受体细胞的运载工具，常用的载体有细菌质粒、λ噬菌体、cosmid质粒和人工染色体等。作为载体应该具备以下几个特征：①能够自我复制或者能够整合到受体细胞的染色体上，这样才能保证目的基因的稳定存在；②易于从寄主细胞分离纯化；③载体DNA分子中有一段不影响自身扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增。另外，载体还具有选择标记基因，便于重组细胞的筛选。下一页上一页返回5生物工程技术基础5/9/20244重组DNA分子的构建(1)限制性核酸内切酶(2)DNA连接酶(3)DNA片段的连接

下一页上一页返回6生物工程技术基础5/9/20245重组DNA分子的导入外源基因导入原核生物的最常用的方法是利用氯化钙诱导大肠杆菌感受态，即将大肠杆菌置于冰冷的氯化钙溶液中，再经过短暂的热刺激，使外源基因易于进入细胞内。噬菌体载体携带外源基因以传染的方式进入受体细胞。此外，电穿孔法在原核生物中应用十分普遍，它是采用脉冲高压电瞬间击穿细胞膜导入外源基因。转基因的植物受体细胞多是除去细胞壁的原生质体，动物受体细胞是干细胞或卵细胞。外源基因导入真核细胞的直接方法有：①基因枪法，用基因枪将表面带有目的基因的金属微粒射入动物细胞中；②显微注射法，利用显微注射仪直接将基因注入细胞中；③电穿孔法；④农杆菌转化法，即以改造的农杆菌Ti质粒转化植物细胞，这是植物基因工程最常用的方法。此外还有脂质体法、磷酸钙共沉淀法等。

下一页上一页返回7生物工程技术基础5/9/2024二、蛋白质工程

蛋白质工程常常被称为第二代基因工程。其基本内容是指以蛋白质结构和功能为基础，通过化学和物理手段，对目的基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质；或者对现有的蛋白质加以定向改造、设计、构建和最终生产出比自然存在的蛋白质功能更优良的蛋白质。蛋白质工程的主要步骤有：①分离纯化目标蛋白质；②测定氨基酸序列即一级结构；③利用X射线晶体衍射和核磁共振等实验手段，分析蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系；④涉及蛋白质的改造方案；⑤对目的基因进行定点突变，改变蛋白质的单个或几个氨基酸，使活性中心或蛋白质构象发生变化，改造涉及载体、受体细胞等多种因素；⑥分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，并评价其改造结果。

下一页上一页返回8生物工程技术基础5/9/2024第二节细胞工程、酶工程和发酵工程一、细胞工程二、转基因动植物三、酶工程四、发酵工程下一页上一页返回9生物工程技术基础5/9/2024一、细胞工程1细胞工程技术原理2细胞培养3细胞融合

下一页上一页返回10生物工程技术基础5/9/20241细胞工程技术原理细胞工程是生物工程的一个重要方面。它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。根据设计要求，按照需要改造的遗传物质的不同操作层次，细胞工程可分为染色体工程、染色体组工程、细胞质工程和细胞融合工程等几个方面。

下一页上一页返回11生物工程技术基础5/9/20242细胞培养细胞培养是指动物细胞、植物和微生物细胞在体外条件下保存和生长。所有细胞培养的相同过程是：取材，进行表面清洗和消毒，有的还需要酶处理以离散细胞；根据细胞的特点配置培养基；采用无菌操作技术将生物材料接种于培养基；最后进行培养、传代和收获。

下一页上一页返回12生物工程技术基础5/9/20243细胞融合两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生融合、重排，导致细胞的合并、染色体等遗传物质的重组的过程称为细胞融合。一般两亲本细胞或原生质体在聚乙二醇诱导剂或电激下会发生融合，转到选择培养基上获得具有双亲遗传性状的杂合细胞。

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二、转基因动植物1转基因动物2转基因植物3干细胞技术

下一页上一页返回14生物工程技术基础5/9/20241转基因动物转基因动物构建是从细胞基因修饰开始。常见的建立转基因动物方法有显微注射法、逆转录病毒法与干细胞法等。(1)显微注射法(2)逆转录病毒感染法(3)胚胎干细胞

(4)精子载体法(5)体细胞核移植法下一页上一页返回15生物工程技术基础5/9/2024(1)显微注射法利用显微操作系统和显微注射技术将外源基因直接注入实验动物的受精卵原核，使外源基因整合到动物基因组，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。这项技术开始于1980年初期的转基因鼠，在20世纪80年代后期被应用到大的家畜(如奶牛和奶山羊)等动物生物反应器的构建上。下一页上一页返回16生物工程技术基础5/9/2024(2)逆转录病毒感染法逆转录病毒可作为转基因载体用于构建转基因动植物。对于鸡受精卵，无法对其进行显微注射操作，比较适合采用逆转录病毒的操作方式。但由于逆转录病毒作为载体具有潜在的致癌性，其载体的构建较为复杂，容纳外源基因的大小也有限，而且获得的子代动物中嵌合体的比例大，使该技术的应用受到了一定的限制。下一页上一页返回17生物工程技术基础5/9/2024(3)胚胎干细胞在20世纪80年代中晚期，随着转基因动物体系的建立，胚胎干细胞分离和体外培养以及胚胎干细胞移植后体内发育获得了成功，胚胎干细胞基因打靶技术也不断成熟，利用胚胎干细胞法建立转基因动物取得了很大的进展。

下一页上一页返回18生物工程技术基础5/9/2024(4)精子载体法该方法是将外源基因与精子共同培养，再通过电穿孔或脂质体介导等方法将外源基因导入成熟的精子，使精子携带的外源DNA进入卵中并受精，从而使外源DNA整合到染色体中。由于这种方法相对简单，利用人工授精过程就可产生转基因动物，因而成为近年来许多学者关注的焦点，特别是在大动物的转基因研究上具有相当重要的意义。

下一页上一页返回19生物工程技术基础5/9/2024(5)体细胞核移植法该技术是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等)为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体，进行动物克隆，进而得到带有外源基因的转基因动物。转基因克隆动物技术的采用，将基因转移效率大为提高，转基因动物后代数迅速扩增，所需动物数大幅度降低。

下一页上一页返回20生物工程技术基础5/9/2024转基因鼠的构建

下一页上一页返回21生物工程技术基础5/9/2024图描述了转基因小鼠的构建实例，即将外来基因转入小鼠体内成为其基因组的一部分。引入的基因(带斑点皮毛)先被分离出来并设计使其携带适当片段，然后将这段基因注入受精卵，方法如下：对一只雌鼠注射激素使其排出大量卵，随后让一只雄鼠与其交配使部分卵受精；将这些卵收集起来，在其受精卵分裂前注入外来基因(皮毛表达成斑点状)物质。这些转基因的卵被移植入另一个雌性鼠体内，在那里发育成型。由于某些卵内基因物质在随意位点与染色体整合而成为老鼠细胞的遗传物质，由这种卵发育成的动物将携带该基因从而成为皮毛呈斑点状的转基因鼠。下一页上一页返回22生物工程技术基础5/9/20242转基因植物

与转基因动物相类似，转基因植物的构建也是从细胞基因修饰开始的。但是，植物细胞的生理特性不同于动物细胞，植物细胞的转基因实现也不一样。转基因植物的构建方法主要有农杆菌导入法、基因枪法、花粉管通道法和原生质体融合法等。(1)农杆菌导入法(2)基因枪法(3)花粉管通道法(4)原生质体融合法

下一页上一页返回23生物工程技术基础5/9/2024(1)农杆菌导入法农杆菌介导所用的基因转移根癌农杆菌和发根农杆菌适用于双子叶植物和部分裸子植物的转基因植物构建。最近研究显示根癌农杆菌的Ti质粒也可向一些单子叶植物(如石万柏、百合、薯蓣等)转移外源基因并表达。先将带目的基因的质粒整合到农杆菌基因组中，再将此农杆菌与植物细胞共同培养36～48[KG*8]h，转化植物细胞，然后分离洗涤去菌后通过组织培养获得转基因植株或者形成冠癭瘤和发状根等组织，所形成的肿瘤或发状根本身即是一种天然的选择标记。野生型根癌农杆菌的Ti质粒由于携带与生长素和细胞分裂素合成有关的基因，使转化的细胞产生过量的植物激素而形成肿瘤。利用这种野生型农杆菌作为基因载体，常使转化的细胞丧失分化能力。发根农杆菌感染后形成的发状根可诱导再生形成植株。下一页上一页返回24生物工程技术基础5/9/2024(2)基因枪法

这种方法用表面附着DNA分子(含目的基因)的金属微粒，经过加速装置，轰击植物细胞，将DNA直接射入植物细胞，转化率可达8％～10％。这种方法不受植物细胞种类限制，快速简单，但设备昂贵。

下一页上一页返回25生物工程技术基础5/9/2024(3)花粉管通道法将目的基因整合后，在植株开花时利用花粉管通道直接导入受体植株。这是由我国科学工作者发明的方法，主要用于棉花转基因研究。其实，从本质上讲转基因培育出来的品种与常规育种的品种的基因都发生了变化，只是方法路径不同、精确程度不同而已。

下一页上一页返回26生物工程技术基础5/9/2024(4)原生质体融合法植物细胞在其原生质体的外面有一层坚韧的细胞壁。要在植物细胞间进行融合作用，首先必须设法除去细胞壁。称去除细胞壁的细胞为原生质体，它含有细胞组成的全部成分。原生质体保持着植物细胞的全能性，在适宜的培养条件下，可以重新长出细胞壁，进行细胞分裂、分化，形成完整的小植株。下一页上一页返回27生物工程技术基础5/9/202428生物工程技术基础5/9/20243干细胞技术

(1)干细胞分类

干细胞即未分化的细胞，是一类具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。机体的各种细胞、组织和器官甚至完整的生物都是通过干细胞分化发育而成的。干细胞分胚胎干细胞(ESC)和组织干细胞两类。(2)干细胞的分离与培养

下一页上一页返回29生物工程技术基础5/9/2024胚胎干细胞的分离及分化

①—受精卵；②—胚囊阶段(5～7天)；③—内层干细胞团；④—培养的未分化的干细胞；⑤—分化干细胞(a为血红细胞，b为神经细胞，c为肌肉细胞)

下一页上一页返回30生物工程技术基础5/9/2024三、酶工程

酶工程主要是研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生等领域的应用。1

酶的固定化和固定化酶反应器

2酶工程的应用

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酶的固定化

与天然酶相比，固定化酶具有以下优点：①可以重复多次使用，而且在大多数情况下，酶的稳定性也有明显改善；②催化反应后，酶与底物以及产物容易分开，产物中没有残留酶，易于分离纯化，使产品的质量有大的提高；③反应条件易于控制，可实现生物催化反应的连续化和自动控制；④酶的利用效率高，单位酶量催化的底物量增加，而用酶量则大为减少；⑤比水溶性酶更适合于多酶催化反应。固定化酶也带来了一些问题和缺点，如：①在固定化过程中，总是有一部分酶会失活，其中以共价键法固定时造成的酶活损失最为严重；②酶被固定到载体后将增加底物和产物的传质阻力。

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酶的固定化

目前各种各样的固定化方法，按所用载体和操作方法的差异，可分为载体结合法、包埋法和交联法等三类，如图所示。离子吸附法；(b)共价耦联法；(c)交联法；(d)聚合物包埋法；(e)疏水作用；(f)脂质体包埋法；(g)微胶囊包埋法下一页上一页返回33生物工程技术基础5/9/202434生物工程技术基础5/9/2024固定化酶反应器各种类型的固定化酶反应器间歇式搅拌罐式反应器；(b)连续式搅拌罐式反应器；(c)多级连续式搅拌罐式反应器；(d)多级串联半连续式操作反应器；(e)填充床式反应器；(f)带循环的填充床式反应器；(g)列管式填充床式反应器；(h)流化床式反应器；(i)搅拌罐-超滤器联合反应器；(j)环流式反应器；(k)螺旋卷式生物膜反应器下一页上一页返回35生物工程技术基础5/9/20242酶工程的应用酶工程技术的应用范围大致有：①对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；②自然酶的分离纯化及鉴定技术；③酶的固定化技术(固定化酶和固定化细胞技术)；④酶反应器的研制和应用；⑤与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。可以毫不夸张地说，人们的衣、食、住、行等几乎都已经离不开酶的应用。下一页上一页返回36生物工程技术基础5/9/2024四、发酵工程

发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。现代发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程学有机地结合起来，利用微生物包括DNA重组技术改造的微生物生产有用物质的工程技术。下一页上一页返回37生物工程技术基础5/9/2024第三节现代生物技术的特点1原料简单2反应条件温和3体系复杂运行可靠4特殊活性5系统紧凑6可提高或扩展人的能力

下一页上一页返回38生物工程技术基础5/9/2024第四节生物技术的一般应用一、在生命科学中的应用二、在医药领域的应用

1新药开发

2疾病的预防、诊断和治疗：

(1)疫苗(2)分子诊断(3)基因治疗

3生物芯片技术三、在农业上的应用四、在能源与环境中的应用

1能源利用和开发

2环境保护五、在工业上的应用

下一页上一页返回39生物工程技术基础5/9/2024第五节现代生物技术的军事应用一、军用生物技术二、军用生物技术的发展前景

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