项目三任务二 微生物的菌种保藏技术

食品微生物检验微生物的菌种保藏技术知识目标1.良好的实验操作习惯2.通过项目教学，培养学生互助合作的团队精神双创目标技能目标1.自主操作，在完成工作任务的过程中不断思考学习，自我构建知识体系2.培养学生分析问题解决问题的能力1.认识菌种保藏所需要的工具和实验仪器2.掌握离心式冷冻真空干燥机的使用方法教学目标思政目标1.掌握几种常用的菌种保藏法的原理及方法步骤2.熟悉微生物分离纯化的概念、原理和方法。

食品微生物检验-微生物的菌种保藏技术目录/Contents010203基本原理菌种保藏方法菌种保藏操作技术微生物的菌种保藏技术

食品微生物检验-微生物的生长与控制（一）微生物菌种保藏的基本原理菌种是一类重要生物资源，菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。在微生物发酵工业中，获得具有良好性状的生产菌种十分不容易。如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活，而且保证高产菌株不改变其表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物的高产能力，即很少发生突变，这对菌种极为重要。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（一）微生物菌种保藏的基本原理微生物菌种保藏技术很多，保藏的原理基本一致。首先挑选优良纯种，最好是采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次要创造一个有利于休眠的环境条件，如采用干燥、低温、缺氧、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等方法，使微生物生长在代谢处于不活跃，生长繁殖受到抑制的环境中。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1.传统保藏方法

（1）斜面保藏法

将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2～4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。

此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易变异、易被污染。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1。传统保藏方法

（2）半固体穿刺低温保藏

将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1.传统保藏方法

（3）液体石蜡保藏法

将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1～2年，普通细菌也可保藏1年左右。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种，还可防止干燥，缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1.传统保藏方法（3）液体石蜡保藏法

处理液体石蜡：将液体石蜡分装于二角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，接着检查是否彻底无菌，即接入肉汤中检查有无杂菌生长。然后放在40℃温箱中，使水分蒸发掉，备用。加石蜡油：用灭菌吸管在无菌操作下将5mL石蜡油注入到已长好菌的斜面上，加入的量以超过斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。保藏：石蜡油封存后，将试管直立，放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1.传统保藏方法（4）

沙土保藏法

①制作沙土管

②灭菌加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。③制备菌液取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面中,用接种环轻轻刮下菌苔。振荡制成菌悬液。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1.传统保藏方法（4）

沙土保藏法

④加样用1mL吸管吸取上述悬液0.1mL至沙土管,再用接种环拌匀。⑤干燥把装好菌液的沙土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气,使之干燥。⑥保藏干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：1.传统保藏方法（5）

甘油保藏法

甘油保藏法是在液体的新鲜培养物中加入适量的经过灭菌的甘油，然后再置于-20℃或-70℃冰箱中保存。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后。能强烈降低细胞的脱水作用。同时在低温条件下。可大大降低细胞代谢水平，达到延长保藏时间的目的。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：2.超低温保藏方法超低温保藏法，即使用超低温冰箱保藏法和液氮超低温保藏法。将微生物细胞直接或离心浓缩后悬浮于液体培养基中或含保护剂的液体培养基中，或者把带菌琼脂块直接浸没于含保护剂的液体培养基中，直接放入-80℃超低温冰箱保藏，或经缓慢冷冻后，再转移至液氮冰箱内，于液相(-196℃)或气相(-156℃)进行保藏。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（二）菌种保藏方法菌种保藏常用方法有：3.真空干燥保藏方法真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（三）菌种保藏操作技术1.材料(1)菌种待保藏的细菌、酵母菌和霉菌。(2)培养基营养琼脂斜面和半固体直立柱(培养细菌)，麦芽汁琼脂和半固体直立柱(培养酵母菌)，高氏1号琼脂斜面(培养放线菌)，马铃薯蔗糖斜面培养基(用蔗糖代替葡萄糖有利于孢子形成及用于培养丝状真菌)，LB液体培养基。(3)器皿试管、接种环、接种针、无菌滴管、带螺口盖和密封圈的无菌试管或1.5mL无菌Eppendorf管、100mL的三角瓶等。(4)试剂无菌液体石蜡、沙士、甘油。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（三）菌种保藏操作技术2、保藏方法与步骤(1)斜面低温保藏法(适用于细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的保藏)①贴标签:将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。②接种:将待保藏的菌种用斜而接种法移接至注明菌名的试管斜面上。③培养:细菌置37℃恒温箱中培养18~24h，酵母菌置28~30℃恒温箱中培养36-60h，放线菌和丝状真菌置28℃下培养4~7天。须用健壮的细胞或孢子作为保戴菌种，例如细菌和酵母菌应采用对数生长期后期的细胞，不

食品微生物检验-微生物的生长与控制（三）菌种保藏操作技术2、保藏方法与步骤宜用稳定期后期的细胞(因该期细胞已趋向衰老)，对放线菌和丝状真菌则宜采用成熟的孢子。④收戴:为防止棉塞受潮长杂菌，管口柳塞外应用牛皮纸包扎，或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4~5℃冰箱保存。保存温度不宜太低，否则斜面培养基因结冰脱水而加速菌种的死亡。

食品微生物检验-微生物的生长与控制（三）菌种保藏操作技术2、保藏方法与步骤(2)固体穿