《生物化学》实验基本知识与操作-赵春澎

生物化学实验课座次安排：

（30人）座次安排：

（31人）座次安排：

（32人）座次安排：

（33人）座次安排：

（34人）座次安排：

（35人）座次安排：

（36人）前言一、生物化学实验课的重要性二、实验室守则1.整齐着装、注意安全、尊师守纪；2.细心听讲、详实记录、按时作业；3.积极参与、规范操作、爱护仪器；4.有序值日、完成报告、批准离开。理论成绩占70分,实验成绩占30分

（临床专业讨论课10分）三、实验考试出勤、实验室综合表现、报告书写10分实验理论考试10分实验操作考试10分四、实验报告的书写

实验X实验名称【实验目的】【实验原理】【实验步骤】【实验结果】【结论分析】

（完成实验后隔日交实验报告，每组一份）生物化学实验基本知识与操作一、目的：1.掌握常用玻璃仪器洗涤及干燥方法。2.熟悉几种常用的液体混匀方法。3.掌握刻度吸量管及加样枪的使用。4.掌握离心技术原理及掌握离心机的使用。5.掌握分光光度技术原理及722型分光光度计的使用。

玻璃仪器清洗程序一般玻璃仪器

毛刷刷洗容量分析玻璃仪器自来水冲洗蒸馏水冲洗

2-3次

自来水冲洗

2-3次洗液浸泡（12-24h）二、内容（一）常用玻璃仪器的清洗与干燥（P9-10）标准：倒置显示内壁，既无成滴水珠，也不成股流下。

pH示中性。玻璃仪器的干燥：①自然干燥：将洗净的玻璃仪器倒置在架子上使水沥净，

室温下干燥；②加热干燥:

容量仪器不可高温干燥；

精密分析量器如需即用，只能在60℃以下干燥；其他一般在105℃-120℃烘箱中干燥。（二）液体的混匀（P10-11）1.旋转混匀法试剂量小，反应时间短，小口径容器2.弹动混匀法适用于试管内液体的混匀；3.倒转混匀法适合具塞的容器，如容量瓶，磨口瓶；4.滴管混匀法用滴管将溶液反复吹打数次；5.玻棒搅拌混匀法大口径或大容量的容器。（三）液体的量取1.

移液管2.

刻度吸量管3.

固定式微量吸量管（胖肚吸管）刻度吸量管的分类：两种分类方法

规格（量取范围）

用法（尖端残液）分为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10ml。分为完全流出式与不完全流出式。“吹”2.

刻度吸量管刻度吸量管的使用方法：拿法：选取：取液：调刻度：放液：清洗：“靠近原则”“三点一线”食指堵塞上端开口，垂直地面插入液面下1~2cm管壁始终与地面垂直最后以蒸馏水润洗2~3次2.

刻度吸量管刻度吸量管使用中的注意事项：拿法：选取：取液：调刻度：放液：清洗：要求一次量取待测液体需要多少试剂，在管内留下多少不允许以拇指堵塞上端开口插入液面下1~2cm即可禁止用嘴吹吸量管禁止甩吸量管2.

刻度吸量管刻度吸量管的使用：

“拿、选、取、调、放、洗”固定式微量吸量管的用途：一种量器，精确的试剂量取和转移。3.固定式微量吸量管

又称为加样枪固定式微量吸量管的辅助设施：吸头与吸头盒3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的设计原理：柱塞定程运动的负压原理密闭管腔吸头移动活塞3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的分类：不同分类方法

规格（量取数值）

用法（量取数量）分为1、2、10、20、250、500、1000ul等。分为单枪与排枪等。3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的使用方法：“轻取重放”取样时：放液时：在第一次阻力处停止在第二次阻力处停止3.固定式微量吸量管固定式微量吸量管的注意事项：精密仪器，轻取轻用就近原则，准确量取取液慢，防污染进展快，多思考轻：准：慢：变：3.固定式微量吸量管生活中的离心技术：（四）离心技术（P78）离心技术的概念：根据不同物质颗粒的沉降系数、密度不同，在同一转速、同一部位受到的离心力不同而出现不同的沉降速度，从而达到浓缩、分离、纯化目的的一种实验技术。（四）离心技术离心技术的原理：①根据力学的基本原理

匀速圆周运动时物体受到的离心力:F=ρvrω2

F：物质作匀速圆周运动时受的离心力

ρ：被分离物质的密度v：物质的体积r：离心半径ω:离心角速度（四）离心技术离心技术的原理：由此可见：

在同一离心机中，同一转速下，离心半径和角速度平方的乘积是固定值，做匀速圆周运动的颗粒所受的离心力大小与颗粒密度相关。（四）离心技术离心技术的原理：②

沉降速度:离心时，在一定条件下颗粒在介质中受力平衡，匀速运动，经计算得：沉降速度V=D2×（ρ颗-ρ介）×rω2/18ηD:颗粒直径η:介质的粘度（四）离心技术离心技术的原理：②

沉降速度:介质与颗粒的密度差决定着颗粒运动的方向、沉降速度。若ρ颗>ρ介，颗粒下沉若ρ颗=ρ介，颗粒悬浮若ρ颗<ρ介，颗粒上浮

（四）离心技术离心技术的常用分类：不同分类方法

速度目的制备性离心：如差速离心和密度梯度离心分析性离心普通离心（6000r/min以下）高速离心（20000~25000r/min）超速离心（50000~80000r/min）（四）离心技术离心技术的科研应用：样品的分离纯化和制备；生物大分子分子量的测定；生物大分子纯度的计算评估；生物大分子构象的分析等。（四）离心技术检查→配平→放置→离心→结束→收整注意：配平时，套管中加液体，

单管离心设配平管；放置时，对称放置；离心时，取出多余套管，离心中勿开盖；收整时，停转后开盖，速度旋钮归零。离心机的使用：离心机的使用：①检查：仪器放置是否平整，是否有异常。②配平：离心管必须要两两配平③放置：等质量的试管必须对称放置

停转后打开盖速度旋钮归零三、注意事项1.容量分析玻璃仪器的清洗方法2.刻度吸量管的握持方法3.加样枪的握持方法4.离心机的使用方法参考教材：学习资料：学习网站：生物化学微课：/course/201084535.html开工！（五）光谱光度分析技术（P16）1.概念：光谱光度分析技术是根据物质具有吸收或发射辐射能的性质，通过测量物质所产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度而建立起来的一种分析方法。优点：灵敏度高，测定简便，快速等优点，

是最为常用的一种生化检测技术。2.比色法与分光光度法有色溶液的颜色深浅，与溶质浓度有关：

颜色越深，浓度越高；颜色越浅，浓度越低。比色法：利用比较溶液颜色的深浅来测知溶液中所含有色物质浓度的方法。分光光度法与比色法相似，只是要求入射光更接近于单色光。3.

基本原理(1)有色溶液与光吸收的关系

光是一种电磁波。

人的视觉所能感觉到的光称为可见光，波长范围在400～760nm；

我们人的眼睛感觉不到的还有红外光（波长大于760nm）、紫外光（波长小于400nm）、X射线等。(2)光的吸收定律――Lambert－Beer定律当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，入射光与出射光强度如何变化。溶液的浓度愈大，则光被吸收得愈多。

通过的液层厚度愈大，则光被吸收得愈多。Ａ：吸光度：可以作为衡量光被吸收程度的一个物理量，吸光度越大，说明被溶液所吸收的光越多。Ｃ：物质的浓度Ｌ：液层厚度。Ｋ：是指吸光系数，是一个比例常数。在一定条件下，吸光系数是物质的特性常数之一，它与光的强度，溶液浓度，液层厚度都无关，只与入射光的波长和物质性质有关。Lambert－Beer定律：A=KCL4.待测溶液浓度的计算：(1)标准管法在同样的实验条件下同时测定标准溶液与待测溶液的吸光度值。标准溶液---就是用待测浓度的那种物质，配成已知的浓度。根据朗伯-比尔定律公式标准溶液：A标=KC标L标待测溶液：A测=KC测L测两式相比A标/A测=C标/C测C测=A测C标/A标(2)标准曲线法①先取与被测物质含有相同组分的标准品，配成一系列浓度不同的标准溶液。

然后分别测其吸光度。③作图：以溶液浓度C为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制曲线图。CuSO4溶液标准曲线绘制范例：CuSO4溶液标准曲线C(g/L)A管号123456CuSO4原液（mL）012345蒸馏水（mL）543210浓度值（g/L）01020304050吸光度（A）CuSO4溶液标准曲线绘制下午的实验操作：？空白管5.分光光度计结构与用法光源：

提供工作所需的所有波长的光。单色器：单色器的作用是从波长范围较宽的光线中，

分出单色光的一个装置。吸收池：放置比色皿，是盛样品或标准液的容器。石英比色皿(波长≤350nm)，玻璃比色皿(波长≥350nm)检测器：对光强度进行测量，并以电信号的形式表示，

这种光电转化设备就被成为检测器。显示器：是将检测器获得的电信号放大，

并能将待测结果的数据显示出来的装置。722G型分光光度计：722G分光仪的操作：开机→预热→配置试剂→设置波长

→校正仪器（调节“０%”和“100%”）

→测定→收整注意：调节“０%”和“100%”的方法和顺序；比色皿的使用方法。开工！实验结果汇总（2018.09.03）：组号A2A3A4A5A6123456789101112实验结果汇总（2018.0