第二章抗体及抗体药物

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第二章抗体及抗体药物2抗体Antibody(Ab):

B细胞识别Ag（antigen）后增殖分化为浆细胞所产生的，具有与Ag特异性结合活性的球蛋白，主要存在于血清等体液中。免疫球蛋白Immunoglobulins

(Ig):将具有Ab活性及化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。34抗体攻击病毒51。IgG分子由两条H链和两条L链共价结合而成。2。轻链包括VL和CL两个结构域。3。重链含有1个VH和3个CH

结构域。VH和VL共同组成抗原结合部位。4。Ig分子中线对称，具有两个相同的抗原结合部位。一、抗体分子的基本结构6FabFc可变区恒定区7决定抗体与抗原结合的特异性和亲和力(Complementarity-determiningregion)81.重链和轻链（Heavy&lightchains）1)重链（Heavychain:H链）①大约53-70kD,糖基(+)②类别:H链：

,,,,.(Ig)IgA,IgG,IgMIgD,IgE92)轻链（lightchain:L链）①大约25kD,糖基(-)②类型（type）:,10

2.可变区(V)与恒定区(C)

（Variable&Constantregions）11高可变区（hypervaribleregion，HVR或CDR)由6－10个氨基酸残基组成的狭小区域内。参与抗原结合部位的组成。123.铰链区（Hingeregion）特点：1)极富弹性，可以自由伸展至180度。这种变构有利于与不同距离的抗原决定簇结合。2)富含脯氨酸功能:1)有利于Ab与Ag的结合2)有利于Ab与补体的结合131415LLHHVLVHFdFvFabFab’FcF（ab’）2抗体分子的基本结构和各种分子片段16

1、V区：识别并特异性结合抗原，与毒素结合可以中和其毒性；与病原体结合，可以阻止其对机体细胞的粘附和感染。2、C区1）激活补体系统2）介导免疫细胞活性3)穿越胎盘和黏膜二、抗体分子的功能1718抗体药物19可用抗体治疗的疾病移植排斥肿瘤自身免疫病心血管疾病感染性疾病过敏性疾病20已在欧美得到批准上市的治疗用抗体21Herceptin(抗体名称)人源化抗体HER-2乳腺癌cell22

至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种。2002年销售额

29亿美元；2003年超过52亿美元；2005年为90亿美元；2010年预计单抗销售额200亿美元。美国已占全球单抗市场90%—一支独秀。23我国体内诊断和治疗用抗体的研制24治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清25一、多克隆抗体26多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）指由不同B细胞产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。特异性差，易出现交叉反应。27传统抗血清抗原免疫所有抗体混合12341234123428二、单克隆抗体29单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）：由单一克隆B细胞杂交骨髓瘤细胞产生的，只识别一种抗原表位的具有高度特异性的抗体。特点：高纯度、高特异性、高均一性、效价高、易大量制备；鼠源性对人具有较强的免疫原性。30杂交瘤技术的基本原理

通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长；小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

31将产生抗体的

脾細胞

与

肿瘤细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起可以培养生長产生专一性抗体一個Bcell只产生一种抗体32

●

一个

B细胞只能生产一种抗体，对应某一

抗原決定簇。●

若有多个抗原決定簇，则需许多株B細胞分別生产多个抗体。BBBYYYY抗原BYB11Y22Y33Y44抗原決定簇33HAT:次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶34蛇毒单抗的制备35Cellfusion36单克隆和多克隆抗体的比较和用途特异性敏感性均一性McAbPcAb低差无高强有1、用于免疫学检测，辅助临床诊断2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原3、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。37理想的抗体药物的性质高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M）对人没有免疫原性，不诱导人抗鼠抗体（HAMA）反应游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行大规模培养抗体符合生物制品标准38

问题异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果靶部位摄取的量太低效应功能弱在体内被清除速度快

对策抗体人源化改变抗体大小连接毒素、药物抗体人源化抗体治疗存在的问题及对策39抗体药物改造的方向抗体人源化和人源抗体制备改变抗体分子大小增强抗体亲和力增强抗体效应功能40

三、基因工程抗体41通过基因重组改良抗体性能通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体421小分子抗体3鼠单抗人源化基因工程改造的抗体2431、鼠单抗人源化●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体●可变区人源化——人改型抗体441）人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。在保留抗原结合性的同时降低了对宿主的免疫原性。45

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。46Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L

链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略

47鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体48

人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。492）鼠单抗可变区的人源化

为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。

CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，又称人源化抗体（humanizedantibody）

。

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经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，但该技术难度较大。51FvScFv单域抗体最小识别单位Fab小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。2、小分子抗体52

小分子抗体的优点:

只有V区结构，免疫原性较低；小分子抗体更容易通过血管壁，穿透实体瘤，有利于肿瘤的治疗。；无Fc段，不会与Fc受体结合，易渗透至病灶区；易于与毒素或酶基因连接，有利于作为导向药物的载体。在大肠杆菌中表达，可发酵生产抗体。从而降低成本，使抗体治疗得以普及。

53

由完整轻链和重链V区及Ch1功能区（Fd）以二硫键形式连接而成，大小为完整抗体分子的1/3。仅有一个抗原结合位点。

(1)Fab54免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体L链表达载体共转染细胞PrVHCH1PrVLCLFab抗体分子的制备55抗体分泌细胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗体分子的制备56

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。

Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL头尾相连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽（linker）57

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，它应当不干扰VH和VL的立体折叠，并且不对抗原结合部为造成妨碍，应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。

58VHVL接头DNA(Gly4Ser)3VH引物PCRVH接头DNA酶切、克隆ScFv(singlechainFv,scFv)的构建变性、复性VL引物VL59

单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:

一是表达为包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;

二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者。60

即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。(3)单域抗体VH61

约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它保持着抗体的特异性。(4)最小识别单位CDR623、抗体融合蛋白

1）将Fv段与其它生物活性蛋白结合，利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性引导于特定部位。主要应用领域：靶向治疗。2）含Fc段的抗体融合蛋白。利用Fc段所特有的生物学功能与某些有粘附或结合功能的蛋白融合又被称为免疫粘附素(immunoadhesin)，Fc段可赋予免疫粘附素以下功能：①通过与抗Ig或蛋白A结合用于检测或纯化；②Fc段介导的抗体效应功能，如固定补体及调理作用等；③增加该蛋白在血液中的半衰期。

63FcproteinSPAthrombinFc的作用：检测、纯化、64hEPO/G-CSFFcFusionProteinDNAligationexpressionFc的作用：延长血清中半衰期654、双特异抗体

双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)指能同时识别2种不同抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原，另1种为对应效应物（药物，效应细胞）。

AgAgDiabody6667

即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。6869

所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。70

抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。5抗体库技术71抗体库技术产生的三项技术基础

RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因

抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达

噬菌体展示技术（phagedisplay)72

它是在PCR技术和PhageDisplay的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基