HYT 147.5-2013 海洋监测技术规程 第5部分：海洋生态

海洋监测技术规程第5部分：海洋生态Codeofpracticeformarinemonitoringtechnology—2013-04-25发布I前言 V 12规范性引用文件 3术语和定义 14浮游病毒总数——染色计数法 25沉积物中病毒总数——染色计数法 46弧菌总数——平板计数法 67肠球菌——最大可能数法(MPN)和滤膜法 68粪大肠菌群——测试片法 6 10分级初级生产力——¹C同位素法 11赤潮甲藻孢囊——光学显微镜法 12微微型浮游植物——荧光显微镜计数法 13微型浮游生物——显微镜个体计数法 2014小型浮游生物——显微镜个体计数法 2415鱼类浮游生物——体视显微镜计数法 2416珍稀濒危动物调查——调访观测法 2717滨海湿地植物——野外勘查法 18腹泻性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 19麻痹性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 20麻痹性贝毒——高效液相法(HPLC) 21记忆缺失性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 22神经性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA) 23金黄色葡萄球菌——测试片法 24沙门氏菌——微孔板试剂盒法 25李斯特菌——测试片法 4226真菌——测试片法 4527海水中副溶血弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 28海水中创伤弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 29海水中河流弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 30海水中溶藻弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 31海水中哈氏弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 32海水中霍乱弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 Ⅱ33海水中鳗弧菌——聚合酶链式反应(PCR)法 34海水中甲肝病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 35海水中诺如病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 36海水中星状病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 37海水中轮状病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 38海水中腺病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 39海水中肠道病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 40虾类桃拉病毒——反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法 41虾类白斑综合征病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 6042鱼类淋巴囊肿病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 43鱼类虹彩病毒——聚合酶链式反应(PCR)法 44贝类帕金虫——雷氏液体巯基醋酸盐培养基培养(RFTM)法和聚合酶链式反应(PCR)法 6145贝类单孢子虫——聚合酶链式反应(PCR)法 46微生物分子鉴定——限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)法 47粪便污染源微生物示踪监测——重复性基因外回文序列聚合酶链式反应(REP-PCR)法 48赤潮藻种分子鉴定——荧光原位杂交(FISH)法 6849海洋污染物生物毒性检验——发光细菌法 7050海洋污染物生物毒性检验——藻类检验法 7351海洋污染物生物毒性检验——多毛类检验法 52海洋污染物生物毒性检验——软体动物检验法 53海洋污染物生物毒性检验——甲壳类检验法 54海洋污染物生物毒性检验——棘皮类检验法 55海洋污染物生物毒性检验——鱼类检验法 56海洋沉积物生物毒性检验——端足类检验法 附录A(规范性附录)记录表 附录B(资料性附录)生理盐水和细菌、真菌计数表 附录C(规范性附录)被检样品中细菌最可能数(MPN)表 附录D(规范性附录)浮游生物样品编号、生物量测定、计数 附录E(规范性附录)比色卡 附录F(规范性附录)沙门氏菌确认检验流程图 附录G(规范性附录)单核细胞增生李斯特菌确认检验流程 附录H(资料性附录)PCR法检测7种弧菌电泳模拟图 附录I(资料性附录)PCR、RT-PCR法检测10种病毒电泳模拟图 附录J(资料性附录)受试生物——日本大螯蜚 图1粪大肠菌群测试片直接计数法检测程序 8图2粪大肠菌群测试片MPN计数法检测程序 Ⅲ图3文昌鱼年龄结构模式图 图4金黄色葡萄球菌测试片直接计数法检验程序 图5金黄色葡萄球菌测试片MPN计数法检验程序 39图6微孔板试剂盒法快速检测沙门氏菌流程 40图7单核细胞增生李斯特菌测试片检验程序 44图8霉菌与酵母菌的检验程序 46图E.1沙门氏菌微孔板试剂盒检测法结果判读比色卡 图F.1沙门氏菌确认检验流程图 图G.1单核细胞增生李斯特菌确认检验流程 图H.1PCR法检测7种弧菌电泳模拟图 图I.1PCR、RT-PCR法检测10种病毒电泳模拟图 表1水样采集层次 表2各种网具规格及适用对象 25表3植物群落样地描述调查表 表4各类麻痹性贝毒检出限参考表 表5用于荧光原位杂交试验的探针情况 表6氯化汞工作液稀释配制系数 71表A.1浮游病毒及微微型浮游生物海上采样记录表 表A.2浮游或沉积物病毒直接计数记录表 表A.3叶绿素采样记录表 98表A.4叶绿素(萃取荧光法)测定记录表 99表A.5初级生产力粒度分级采样、过滤、测定记录表 表A.6微微型光合浮游生物细胞数量记录表 表A.7微型浮游生物海上采样记录表 表A.8微型浮游生物样品登记表 表A.9水样浮游生物标本个数计数记录表 表A.10微型浮游生物标本个数计数记录表 表A.11微型浮游生物数量统计表 表A.12微型浮游生物种类名录 表A.13鱼类浮游生物海上采集记录表 表A.14鱼类浮游生物标本登记表 表A.15鱼类浮游生物计数记录表 表A.16鱼类浮游生物数量统计表 表A.17海洋珍稀濒危游泳动物观测记录表 表A.18海洋珍稀濒危游泳动物观测结果统计表 表A.19珍稀濒危海鸟类样点观测记录表 表A.20珍稀濒危海鸟类样带观测记录表 表A.21文昌鱼现场采样记录表 表A.22文昌鱼种群结构室内分析记录表 表A.23滨海湿地植物调查记录表 表A.24海水中病原性弧菌检测记录表 表A.25海洋病毒记录表 表A.26鱼类淋巴囊肿病毒检测记录表 表A.27生物毒性检验现场采样记录表 表A.28发光细菌急性毒性测定试验记录表 表A.29发光细菌法测定环境毒性的分级标准 表A.30藻类毒性试验记录表 表A.31百分率与概率单位换算表 表A.32藻类毒性试验数据统计换算登记表 表A.33海洋生物毒性试验记录表 表A.34海洋生物毒性试验数据统计换算登记表 表A.35端足类毒性试验生物结果记录表 表A.36端足类毒性试验物理结果记录表 表A.37端足类毒性试验生物结果统计表 表B.1细菌(真菌)测试片直接计数表 表C.1被检样品中细菌最可能数(MPN)表 V——第1部分：海水；——第2部分：沉积物；——第3部分：生物体；——第4部分：海洋大气；——第5部分：海洋生态；——第6部分：海洋水文、气象与海冰；——第7部分：卫星遥感技术方法。本部分为HY/T147的第5部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家海洋环境监测中心提出。本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本部分起草单位：国家海洋环境监测中心、国家海洋局南海环境监测中心、国家海洋局东海环境监测中心、国家海洋局北海环境监测中心。1海洋监测技术规程第5部分：海洋生态1范围HY/T147的本部分规定了海洋生物生态的样品采集、试验、分析、资料整理等方法的技术要求。本部分适用于近岸、近海、远海海域的生物生态的监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB3097海水水质标准GB4789.4—2010食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.30—2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB4789.38食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数GB/T12763.1海洋调查规范第1部分：总则GB/T12763.6—2007海洋调查规范第6部分：海洋生物调查GB17378.3海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输GB17378.5海洋监测规范第5部分：沉积物分析GB17378.7—2007海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测GB18668海洋沉积物质量GB19489实验室生物安全通用要求海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。浮游生物plankton缺乏发达的运动器官，没有或仅有微弱的运动能力，悬浮在水层中，常随水流移动的生物。包括浮游植物和浮游动物两大类。浮游生物依个体的大小可分为以下几种类型：粒径小于2μm的称微微型浮游生物(picoplankton);粒径为2μm～20μm的称微型浮游生物(nanoplankton);粒径为20μm~200μm的称小型浮游生物(microplankton或netplankton);粒径为200μm～2000μm的称中型浮游生物(mesoplankton);粒径为2000μm～20mm之间的，称为大型浮游生物(macroplankton);粒径大于20mm的称巨型浮游生物(megaplankton)。此外，鱼类浮游生物(ichthyoplankton)即为鱼卵和仔稚鱼。距离抽样distancesampling利用不同距离和生境内的鸟类辨识技术，在一定范围或距离内估算鸟类数量，收集生态种群数据。2抽样方法包括样点法和样带法。在一定时间内，观察者于固定的观察点对鸟类进行观察计数的方法，可以用于估计鸟类种群的相对密度，也可与距离估测结合计算绝对密度。该方法适用于调查高度可见的、鸣叫的以及在广阔生境中的在一定时间内，观察者沿固定的线路行进，并对线路两侧所见到的鸟类进行观察计数的方法，行进方式在陆地上可以是沿样带行走、驾车，在海上可行船，或在空中飞行。该方法适用于调查高度开放生境中的鸟类，也适用于调查离开海岸的海鸟和水鸟。微生物源示踪microbialsourcetracking以某些具有代表性的微生物作为示踪因子，对环境样品中的污染物质进行跟踪溯源的监测技术。将独有的基因片段作为特异性的指纹标记，用以判断基因来源而构建的比对用数据库。沉积物毒性检验sedimenttoxicit通过将试验生物直接暴露于沾污沉积物的方法来确定沉积物中污染物质的生物效应。在实验室通过在清洁沉积物或海水中按一定浓度加入一种或几种具有潜在毒性化学物质的过程。沉积物毒性检验试验中加入试验容器里面固相沉积物上面的试验海水。4浮游病毒总数——染色计数法4.1适用范围本方法适用于海水中浮游病毒的丰度检测。4.2方法原理荧光染料SYBRGreenI与病毒核酸嵌合，在荧光显微镜蓝色光激发下呈针扎状、亮绿色。根据颗粒大小分辨浮游病毒。4.3仪器设备仪器设备应符合以下要求：a)落射荧光显微镜；3e)离心管：5mL～15mL,用5%HCl溶液浸泡1d以上，经0.02μm滤膜过滤的蒸馏水漱洗并高压灭菌；f)无色指甲油。4.4试剂及其配制试剂及其配制要求如下：a)戊二醛溶液：市售分析纯级；b)SYBRGreenI:市售，冷冻暗保存；c)10%p-苯二胺储备液：避光冷冻保存；d)PBS甘油储备液：将50%的PBS(8.5gNaCl,2.2gNa₂HPO₄,0.15gNaH₂PO₄,1000mL蒸馏水，pH值为7.5)和体积分数为50%的甘油混合，冷藏保存。4.5样品采集与处理样品采集详细信息记录于表A.1。取水样15mL～50mL置于灭菌离心管中，加固定剂戊二醛溶液至终浓度为0.5%;避光冷藏保存，应在7d内分析；超低温(一80℃)避光保存，宜在30d内分析完毕。4.6分析步骤分析步骤如下：a)滤器装配：长期未用的滤器应先装好滤器和抽滤装置，用经0.02μm滤膜过滤的高压灭菌蒸馏水加满滤筒并抽滤清洗2次～3次(当天使用的滤器，在各个样品测定前用同样方法清洗一次，清洗时不应取下衬垫滤膜);卸下滤筒在衬垫滤膜上放置氧化铝滤膜，装配好滤筒。b)配制染色剂：取出SYBRGreenI,用经0.02μm滤膜过滤的无菌去离子水按1:10稀释，操作应在弱光环境中进行，未用完的染色剂应立即避光冷冻保存。c)配制荧光保护剂工作液：取10%的p-苯二胺储备液，化霜、摇匀后吸取10μL与990μLPBS甘油储备液混合，制成工作液。d)加样：加入0.1mL～2mL样品(视野病毒数控制在200个以下),若样品量少于1mL则应加入经0.02μm滤膜过滤的超纯水稀释至1mL,再加样。e)抽滤：在负压15kPa～20kPa条件下，把样品抽滤至干。f)染色：用移液器吸取97.5μL经0.02μm滤膜过滤的无菌去离子水，滴入干净的无菌塑料培养皿，再加入2.5μL10%的SYBRGreenI染色剂工作液(染色剂浓度为0.25%),取下氧化铝滤膜，将膜的非载样面放在培养皿的染色液上，冰浴、避光染色15min。g)制片：染色后，取出滤膜，吸干滤膜背面及边缘的液滴，把滤膜紧贴于灭菌载玻片上(载样面朝上),加30μL荧光保护剂，加上盖玻片，滤膜上下两面均不应有气泡，用无色指甲油密封盖玻片四周，制片可冷冻保存30d。h)计数：在荧光显微镜蓝色滤光片、油镜下观测，病毒颗粒呈针扎状、亮绿色，细菌亦呈亮绿色，但其亮度强于病毒颗粒，且菌体比病毒颗粒大得多。随机选取至少20个视野，计算病毒颗粒数。记录总数不少于300个病毒颗粒。4.7记录和计算将记录和计算结果记入表A.2中。4 (1)4.8注意事项d)未用完的10%p-苯二胺储备液应立即冷冻保存，但累计冻、融不应超过3次；如果储备液呈棕见4.2。g)其他仪器设备见4.3。5c)加入经0.02μm氧化铝膜过滤的戊二醛灭菌海水溶液4mL(终浓度2%),冷藏保存直到c)用旋涡振荡器振动样品1min,于1000r/min条件下离心1min;见4.6: (2)c)其他见4.8。66弧菌总数——平板计数法按《海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查》的要求执行。7肠球菌——最大可能数法(MPN)和滤膜法按《海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查》的要求执行。8粪大肠菌群——测试片法8.1适用范围本方法包括直接计数法与最大可能数(mostprobablenumber,简称MPN)计数法，当两种方法所获结果发生矛盾时，以直接计数法为仲裁方法。8.2直接计数法大肠菌群测试片是一种预先制备好的培养基，含有紫罗兰红胆汁(VRB)培养基、冷水可溶性凝胶和氯化三苯四氮唑(TTC)指示剂等，可增强大肠菌群菌落的计数效果。同时该培养基系统表面覆盖的胶膜可截留发酵乳糖而产生的气体，因此红色菌落周围有气泡形成。44.5℃±0.5℃培养24h±2h后计数周围有气泡的红色菌落数，即为粪大肠菌群数，亦称耐高温大肠菌群数。8.2.2仪器设备仪器设备应符合以下要求：a)超净工作台；b)恒温培养箱：44.5℃±0.5℃;c)干热灭菌箱；d)冰箱：2℃~5℃;e)高压蒸汽灭菌器；g)天平或电子秤：感量0.1g;i)无菌培养皿：直径90mm;j)无菌试管：180mm×18mm;k)无菌采水瓶、击开式采水器；m)大肠菌群测试片压板：1mL,5mL;n)移液器及其吸头或无菌吸管1mL、10mL;o)75%酒精棉球；q)一次性无菌乳胶手套；7r)一次性无菌塑料袋；t)采集网箱养殖鱼类、甲壳类的手捞网；u)灭菌玻璃研钵或均质器(旋刀式或拍击式);v)放大镜、菌落计数器或菌落自动判读仪。8.2.3试剂和测试片试剂和测试片如下：a)生理盐水：参见附录B;b)高灵敏度大肠菌群测试片；c)大肠菌群测试片。8.2.4样品采集与预处理8.2.4.1海水样品海水样品的采集和预处理如下：a)采集：根据需要使用击开式采水器和无菌采水瓶采取表层或其他水层海水样品100mL~200mL,并立即冷藏保存，24h内送回实验室进行检验分析，细菌(真菌)计数表要求记录采样b)预处理：无菌移取海水样品5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10-1稀释样品；依此类推，无菌移取10-1稀释样品5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10-2稀释样品。8.2.4.2沉积物样品沉积物样品的采集和预处理如下：a)采集：用无菌刀先刮去采泥器采取的表层沉积物表面，再用无菌勺根据需要挖取约100g~200g沉积物样品并装入无菌塑料袋中，挤出袋内空气，将袋口扎好，做好标签，再将此袋和做好的标签一起放入另一个无菌袋中。将外层袋内空气挤出、袋口扎好，冷藏保存，24h内送回实验室进行检验分析，细菌(真菌)计数表要求记录采样时间、现场水温、盐度等参见附录B;b)预处理：用无菌不锈钢勺无菌移取表层沉积物样品5g至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10-1稀释样品；再无菌移取10-1沉积物稀释样品5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10-2稀释样品；依此类推，可以制备生物样品的采集和预处理程序如下：a)采集：1)采集贻贝、牡蛎等附着性贝类，首先将刮刀用酒精棉球消毒，然后用刮刀将贻贝或牡蛎从附着物上采集下来。再带好一次性消毒手套随机选取无机械损伤的活贝样品于无菌塑料袋中，每个样品根据需求和采集对象的规格，采集5个～30个(能剖出10g～80g鲜重贝肉)即可。挤出袋内空气，将袋口扎好，做好标签，再将此袋和做好的标签一起放入另一个无菌袋中。将外层袋内空气挤出、袋口扎好，冷藏保存，24h内送回实验室进行检验82)采集文蛤、杂色蛤、四角蛤蜊等底埋性贝类，首先将耙贝类耙子用酒精棉球消毒，耙取底埋贝类，然后再戴好一次性消毒手套将耙出的贝类样品采集到无菌塑料袋中。把样品装入无菌袋中，做好标签、扎好袋口，做好记录，样品及时冷藏保存。3)采集浮筏养殖的海带、裙带菜等大型藻类样品，首先将剪取样品的剪刀用酒精棉球消毒，然后再戴好一次性消毒手套剪取大型藻类样品并装入无菌塑料袋中，做好标签、记录，样品及时冷藏保存。4)采集网箱养殖的鱼类、甲壳类样品，首先将捞取样品的手抄网用紫外线消毒，然后再戴好一次性消毒手套捞取养殖的鱼类、甲壳类样品，并装入无菌塑料袋中，做好标签、记录，样品及时冷藏保存。上述各种生物样品采集的同时细菌(真菌)计数表要求记录采样时间、现场水温、盐度等参见附录B。所有生物样品都应在24h内送回实验室进行检验分析。b)预处理：无菌剖(剪)取生物样品5g,并剪碎至无菌玻璃研钵中，无菌研磨成肉糜后加入45mL无菌生理盐水，充分稀释，制备成10-1稀释样品；再无菌移取10-1稀释样5mL至装有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分稀释，制备成10-²稀释样；依此类推，可以制备10-3、10-4稀释样品。8.2.5检验操作程序检验操作程序如图1所示。5g(5g(mL)(海水、沉积物、生物)样品图1粪大肠菌群测试片直接计数法检测程序8.2.6接种和培养8.2.6.1大肠菌群测试片接种和培养根据所采集样品性质和检测目的需要，选取1个～2个稀释度的样品稀释液，每个稀释液平行接种93张测试片。将大肠菌群检验测试片置于超净工作台上，揭开上层膜，用移液器吸取样品稀释液1mL垂直滴加在测试片的中央处，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生；把压板(平面底朝下)放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面上(切勿扭转压板),拿起压板，静置至少1min使培养基凝固；将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不应超过20片，44.5℃±0.5℃培养8.2.6.2高灵敏度大肠菌群测试片接种和培养根据所采集样品性质和检测目的需要，选取1个～2个稀释度的样品稀释液，每个稀释液平行接种3张测试片。将高灵敏度大肠菌群测试片置于超净工作台上，揭开上层膜，用移液器吸取样品稀释液5mL垂直滴加在测试片的中央处，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生，把压板放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面上(不应扭转压板),拿起压板，静置2min～5min使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不应超过10片，44.5℃±0.5℃培养24h±2h。8.2.7菌落计数与判读选择菌落数在15个～150个之间的测试片，目视或使用放大镜、菌落计数器以及自动判读仪来计数菌落数。在大肠菌群测试片上，红色有气泡的菌落确认为粪大肠菌群。将测试片圆形面积内的菌落数计为粪大肠菌群数，培养圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡、大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明粪大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品来获得准确的粪大肠菌群数。在高灵敏度大肠菌群测试片上，红色有气泡的菌落被确认为粪大肠菌群。当粪大肠菌群大量产酸时，菌落周围会产生粉红色的菌晕使计数更加方便。当培养区域出现大量气泡、大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明粪大肠菌群的浓度较高，需要进一步稀释样品来获得准确的粪大肠菌群数。8.2.8结果报告3张大肠菌群测试片上菌落平均数乘以稀释倍数即为每克(或每毫升)样品中粪大肠菌群数，以“CFU/g(mL)”表示；3张高灵敏度大肠菌群测试片上菌落平均数乘以稀释倍数即为每5g(或5mL)样品中粪大肠菌群数，以“CFU/g(mL)”表示应再除以5。所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数作报告。所有稀释度的菌落数都大于150个时，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数作报告，当测试片上菌落数大于150个时，可计数1个或2个具有代表性的方格(1cm²)内的菌落数，单个方格内的菌落数乘以培养面积即为测试片上估算的菌落数(大肠菌群测试片培养面积为20cm²,高灵敏度大肠菌群测试片培养面积为60cm²)。所有稀释度测试片上的菌落数都小于15个，则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数作报告。8.3MPN计数法8.3.1MPN法检验程序检验程序见图2。24h±2h见8.2.4:选取3个稀释度的样品(海水样品可包括原水样),每个稀释度接种3张测试片(如：海水样品可取3个原水样、3个10-1稀释样、3个10-²稀释样各1mL接种到大肠菌群测试片中)。将大肠菌群测试片箱内，堆叠片数不应超过20片，44.5℃±0.5℃培养24h±2h。结果计算与判读见8.2.7,根据粪大肠菌群阳性测试片数，查M检测过程中的所有培养物收集后，应经121℃高压灭菌15min处理。所有废弃物应小心处置，并9分级叶绿素a——荧光法9.1适用范围本方法适用于海洋生物生态监测分级叶绿素a的样品采集、分析及资料整理。9.2方法原理通过不同孔径的滤膜把不同粒径的浮游植物分别截留下来，对不同粒度的浮游植物进行分级测量。粒级分为20μm～200μm(小型)、2μm～20μm(微型)和小于2μm(微微型)。叶绿素a的丙酮萃取液受蓝光激发产生红色荧光，过滤一定体积海水所得的浮游植物用90%丙酮提取其色素，使用荧光计测定提取液酸化前后的荧光值，计算出海水中叶绿素a的浓度。9.3一般规定9.3.1技术设计与要求技术设计内容包括：监测计划编制及监测项目、监测要素、监测站位、监测方法、监测时间、监测频率、监测船只要求、监测人数及其专业素质、器材设备、预期成果等。叶绿素a分级监测宜与化学、水文物理等同船、同站、同步监测。9.3.2监测方式分为大面观测、断面观测和连续观测等几种。9.3.2.1样品采集方法和种类采用采水器(瓶)采集叶绿素a样品进行测定。采集水层规定见表1。表1水样采集层次测站水深范围225表层、5、10、30、50、75、100、150、底层表层、5、10、30、50、75、100、注1:表层指海面下深度0.5m以内的水层；注2:水深小于50m时，底层为离底2m的水层；注3:水深在50m～200m时，底层为离底5m的水层；注4:可根据调查的特殊需要，酌情增加200m以深的采水层次；注5:条件许可时，应充分考虑跃层和采集叶绿素次表层最大值9.3.2.2监测时间、监测频率和季节划分受气象、流系季节性影响的边缘海应每季度监测一次；受气候、水文季节性影响且物质来源复杂的河口、港湾和沿岸海域，至少每月监测一次，如有特殊需要可酌情增加监测次数。在逐季、逐月调查中，各季、各月监测的时间间隔应基本相等。进行河口、港湾监测时，应充分考虑潮期的影响。一般以3月～5月为春季，6月～8月为夏季，9月～11月为秋季，12月～翌年2月为冬季。在一年4次监测中，亦可以5月、8月、11月和2月的调查分别代表春、夏、秋和冬四季的监测。但在热带海域应根据具体的海洋环境条件和监测目的酌情调整监测时间和监测次数。9.3.2.3定位按GB/T12763.1中的有关规定进行。9.3.3出海准备海上所需物品，均应计算实用量和备用量；仪器设备的安装，工具器皿的存放等，应以安全、方便为基本原则。9.3.4仪器设备9.3.5样品采集9.3.5.1采样要求9.3.5.1.1采样位置现场采样时，应避开监测船的排污口。9.3.5.1.2海水样品的采集采水器入水前应检查球盖是否打开，出水阀是否关闭，准确放至预定水层。应按GB/T12763.1有关规定进行记录。样品采集、分析、鉴定和测定记录表见表A.3和表A.4。9.3.6样品分析应按GB/T12763.1有关规定的具体要求处理。9.4技术要求和测定要素9.4.1技术要求9.4.1.1精密度叶绿素a浓度在0.5mg/m³水平时，重复样品的相对误差为±10%。9.4.1.2仪器设备仪器设备应符合以下要求：a)荧光计：激发光波长450nm,发射光波长685nm;b)抽滤装置：包括滤器、支架、抽滤瓶和真空泵；c)玻璃纤维滤膜：其截留效率相当于0.65μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜；d)冰箱。9.4.1.3.1丙酮：体积分数为90%。9.4.1.3.2盐酸：体积分数为10%。用90%丙酮提取其叶绿素a,或者用90%丙酮溶解一定量的市售叶绿素a结晶，浓度约为p=1mg/L。9.4.1.3.6叶绿素a标准工作溶液配制：用9.4.1.3.4中的标准叶绿素a溶液配制浓度不同的标准工9.4.1.3.7换算系数Fa的测定：上述不同浓度的标准工作溶液，在a)采水量：过滤海水的体积视监测海区而定，富营养海区可过滤50cm³~100cm³;中营养海区可过滤200cm³~500cm³;寡营养海区可过滤500cm³~1000cm³;接用0.65μm玻璃纤维滤膜过滤，另一份依次通过20μm筛绢(无抽滤负压条件)、2μm核孔滤膜和0.65μm玻璃纤维滤膜三种规格b)每批样品测定前后，以90%丙酮作对比液，测出各量程挡d)加1滴体积分数为10%盐酸于测定池中，30s后测定其荧光值R。;9.5.1.2按式(5)计算水柱叶绿素a的含量： (6)测试结果记入表A.4。等值线取值标准(单位为mg/m³):0.10,0.20,0.30,0.50,0.75,1.00,1.50,2,00,3.00,5.00,10.00。以上取值标准，可视具体情况增减。10.1适用范围本方法适用于海水中的分级初级生产力的调查与监测。把一定数量的放射性碳酸氢盐H¹*CO₃-(或碳酸盐¹⁴CO₃²-)加入到已知二氧化碳浓度的海水样品中，经过一段时间培养，测定浮游植物细胞内的有机¹⁴C活度，计算浮游植物光合作用速率。根据光合作用速率和粒径分级方法，计算得到分级初级生产力。仪器设备应符合以下要求：a)水下光量子仪或透明度盘；b)液体闪烁计数仪、通风橱和振荡器；c)样品培养箱或培养瓶罩：用中性衰光材料，将光衰减为100%、50%、30%、10%、3%和1%;e)滤膜：直径25mm、孔径为0.65μm的玻璃纤维滤膜(GF/F);孔径为2μm的聚碳酸脂核孔滤f)1mL～10mL移液器及配套的吸液头；g)100mL～250mL培养瓶：2%稀盐酸浸泡24h以上，经蒸馏水清洗数次；h)5L无菌瓶；i)采水器：不透光且没有铜制部件。10.4试剂及其配制试剂及其配制要求如下：a)过滤海水：用调查海区的海水，经GF/F滤膜过滤，置于无菌瓶中备用；b)¹“C工作溶液：用过滤海水稀释NaH*CO₃,使放射性浓度约为1.850kBq/mL;采集水样应使用不透光和没有铜制部件的采水器，水样避免阳光直射。10.5.2采样深度的确定采样水层确定如下：a)真光层深度的确定：使用水下光量子仪，测定表层海水光强和1%表层光强值，得到真光层深b)当真光层深度不大于3m时，仅采表层水样；c)当真光层深度大于3m、不大于10m时，采表层(100%)、10%和1%表层光强层次水样；d)当真光层深度大于10m时，采100%和光衰减至50%、30%、10%、3%和1%光强层次水样； (7) (8)黑瓶，表层样品和10%表层光强水体样品还应各分装一个零时间培养瓶(或根据现场调查情况选定),取相同体积的¹*C工作溶液加至每个培养瓶。所加数量视样品中浮游植物多少和培养时间而定。宜在水深小于200m,培养24h,加37kBq～370kBq,水深大于200m加370kBq～740kBq。培养时间宜在2h～24h之间。入0.5mL的0.5mol/L盐酸，15min后加盖。或在通风橱内以浓盐酸蒸汽熏蒸滤膜15min,放入闪烁瓶.过滤后的滤膜载物面朝上平铺于闪烁瓶底，冷冻保存。在通风橱内，每个闪烁瓶中加入0.5mL向装有滤膜的闪烁瓶加入10mL闪烁液，在振荡器上振荡至少20min,将闪烁瓶置于液体闪烁计数仪内使样品暗适应12h后测定放射性活度，并记录p(C)=(0.067S-0.05)×0.96×12000 (9)式中：p(C)——海水中二氧化碳的总浓度(以C计),单位为毫克每立方米(mg/m³);b)直接测定海水中的二氧化碳浓度式中：Pv——海洋初级生产力(以C计),单位为a)小型浮游植物初级生产力是20μm孔宽的筛绢截留所测值；b)微型浮游植物初级生产力是孔径2μm的核孔滤膜截留所测值减去a)的结果；c)微微型浮游植物初级生产力是GF/F滤膜截留所测值减去b)结果。Ps——水柱初级生产力，单位为毫克每平方米小时[mg/(m²·h)];将计算结果记录在表A.5中。e)将水柱初级生产力单位mg/(m²·h)转化为mg/(m²·d)时，根据各地实际(纬度和季节)光12.2方法原理根据微微型浮游植物所含色素荧光特性的不同，利用荧光显微镜的蓝色(410nm～490nm)和绿色(510nm～560nm)滤光片可将微微型浮游植物分为单细胞的聚球藻蓝细菌和微微型光合真核生物。12.3仪器及设备仪器设备应符合以下要求：a)落射荧光显微镜应配备蓝色和绿色滤光片；c)醋酸纤维滤膜，直径25mm,孔径0.2μm、0.45μm;e)样品保存瓶：50mL螺盖塑料瓶，用5%的HCl溶液浸泡1d以上，并经0.2μm醋酸纤维滤膜过滤的蒸馏水漱洗并高压灭菌。戊二醛溶液(分析纯级)或多聚甲醛溶液(10%)。12.5样品采集与分析12.5.1采样操作与样品保存采样操作与样品保存如下：a)水样采集使用无菌采水器进行采集，水样采集详细信息记录于表A.1;b)按照表1规定的采样层次，采集50mL水样，并用孔径20μm的筛绢过滤。然后加戊二醛或多聚甲醛溶液固定(终浓度1%),冷藏避光保存至实验室分析。12.5.2分析步骤分析步骤如下：a)利用黑色核孔滤膜，过滤10mL～50mL水样，负压不应超过50kPa;b)将黑色核孔滤膜取出放在载玻片上，载物面朝上，在滤膜上加一滴无菌蒸馏水，盖上盖玻片，滤膜两面均不应有气泡；c)在落射荧光显微镜下使用蓝色激发光，40倍物镜观察，应随机选取至少20个视野。分别计数具有橘黄色荧光的含藻红蛋白的聚球藻细胞和呈砖红色荧光的含叶绿素的微微型光合真核生物细胞。绿色激发光用来辅助观测校对，一般情况下绿色激光下记录的红色颗粒为所有微微型浮游光合生物。记录总数应大于200个；d)计数结果记录于表A.6中。12.6记录与计算微微型浮游植物丰度单位以个/mL表示。落射荧光显微镜测试结果按式(14)计算：式中：N——样品中细胞丰度，单位为个每毫升(个/mL);N₄——各视野平均细胞数，单位为个；S——滤膜滤水面积，单位为平方厘米(cm²);S₁——显微镜视野面积，单位为平方厘米(cm²);f——所加固定剂终浓度；V——过滤样品体积，单位为毫升(mL)。计算结果记录表格式见表A.6。12.6.3绘制分布图分布图的绘制要求如下：a)用绘图软件绘制微微型浮游植物细胞丰度平面分布图；b)平面分布图一般用等值线表示，丰度取值标准为5,10,50,100,500,1000,5000,10000(单位为个/mL)。以上取值标准，可视具体情况酌情增减。12.7注意事项本试验执行中应注意的事项如下：a)对悬浮物含量较高的样品，应在分析前静置10h以上；b)样品应在30d内分析完毕；c)荧光显微镜操作宜在暗室环境中进行。13微型浮游生物——显微镜个体计数法13.1适用范围本方法适用于海洋生物生态监测微型浮游生物的样品采集、分析测试及资料整理。13.2方法原理将少量待测样品的混匀悬浮液置于浮游植物计数框中，按照微型浮游生物分类原则，于显微镜下直接计数和分类。13.3一般规定13.3.1技术设计与要求技术设计内容包括，监测计划编制及监测项目、监测要素、监测站位、监测方法、监测时间、监测频率、监测船只要求、监测人数及其专业素质、器材设备、预期成果等。微型浮游生物监测时，宜与化学、水文物理等同船、同站、同步监测。13.3.2监测方式生物监测的方式有大面观测、断面观测和连续观测等几种。用采水器(瓶)采集微型浮游生物样品。采集水层规定见表1。见9.3.2.2:h)取样管；k)支架。13.5试剂及其配制13.6样品采集13.6.2采样要求13.6.2.1采样位置海洋生物监测现场采样时，应避开监测船的排污口。13.6.2.2采水量水深大于200m的海区，每次采水不少于1000mL;水深小于200m的海区不少于500mL;发生富营养化或赤潮海区视具体情况而定，每次采水100mL。13.6.2.3样品采集与保存样品采集与保存步骤如下：a)用采水器采水，入水前应检查采水器的球盖是否打开，出水阀是否关闭，准确放至预定水层；b)主要采集特定水层个体2μm～20μm的微型金藻、微型甲藻、微型硅藻、无壳纤毛虫和领鞭虫等样品；c)按预定水层和规定量采集水样。如需去除大于20μm的生物，可先用孔径20μm的筛绢预过滤。将采集好水样装入采样瓶内，样品用鲁哥氏液固定，每1L水样加入10mL～15mL,根据样品的实际浓度可作适当增减；d)如需要对样品做电镜观察分析，则选用戊二醛固定，根据样品浓度可加入样品体积的e)分析、测量、鉴定后的样品，可依资料分析、应用程度和学术价值高低确定全部或部分保留。各监测项目均应按GB/T12763.1有关规定进行记录。样品采集、分析、鉴定和测定记录表的格式见表A.7～表A.12。遇异常现象或新发现，除进行笔录外还应进行现场摄像或录像。13.7样品分析13.7.1样品编号各类样品应有总编号。总编号由代表采样海区、采样方式、使用网型、采样年份和样品序号等内容的代号依次组成，每份贮存样品的瓶外应贴有总编号的外标签，瓶内应放有总编号、站号和采样日期等内容的内标签(见附录D),填写表A.8。13.7.2样品分类鉴定与丰度测定标本鉴定宜采用活体与固定样品相结合、网采与水样样品相结合的方法；定量计数宜以水样样品为准，水柱的定量计数宜以网采样品为准。除需作特殊处理的微型浮游生物种类以及培养观察的特殊类群之外，原则上鉴定到种的标本比例在80%以上；鉴定到属的比例应在90%以上。水样样品每次实际标本镜检数不少于100个～200个。13.7.3沉降计数法将混合水样均匀吸取3个分样装满3个等容量(10mL～20mL)的沉降器，盖上盖玻片，静置24h,经沉降后分别置于倒置显微镜下鉴定计数，求其平均单位体积海水中微型浮游生物细胞总量(单位：个/mL)。计数结果填入表A.9。水样浮游生物数量分别以个/mL或个/L表示。丰度计算方法如下：a)用绘图软件绘制微型浮游生物及其优势种细胞丰度平面分布图；b)平面分布图一般用等值线表示，丰度取值标准为5,10,50,100,500,1000,5000,10000(单位为10²个/L);15.1适用范围15.2方法原理水深不小于200m的海区拖网深度为200m至表面垂直拖网，水深小于200m的则由海底至表面水平拖网深度为表层0m～3m。网具名称网长网口内径网口面积1生物网拖曳及30m以深、200m以浅垂直采2游生物网适用于30m以浅垂直采集鱼卵和高度为5m～6m(深水拖网大于6m)。负荷为500kg～1000kg;吊杆的舷间距1m左右，并能调在海水表层(0m～3m)进行水平拖网10min～15min,船速为1kn～2kn。所用网具、水层和拖由海底至海面垂直拖网。落网速度为0.5m/s;起网速度为0.5m/s～0.8m/s。所用网具见表2,15.4.2.3样品处理15.5样品分析 (18)a)鱼卵和仔、稚鱼总量(单位为ind/m³或ind/100m³):1,5,10,25,50,100,250,500,1000,b)鱼卵和仔、稚鱼主要科、属(单位为ind/m³或ind/100m³):1,5,10,25,50,100,200,300,400,c)数量小于上述a)、b)等级时，可用“+”标在测站上，以示出现；d)取值标准，可视具体情况酌情增减。15.6.2.2圆圈的取值标准圆圈的取值标准如下：a)鱼卵和仔、稚鱼总量(ind/m³或ind/100m³)为>0～1,>1～10,>10～25,>25～50,>50~100,>100～250,>250～500,>500>25～50,>50～100,>100～200,>200～300,>400～500,>5c)数量小于上述a)、b)等级时，可用“+”标在测站上，以示出现；d)取值标准，可根据具体情况酌情增减。16珍稀濒危动物调查——调访观测法16.1适用范围本方法适用于海洋珍稀濒危动物的调访和观测。16.2方法原理以调访和观测等途径，对海洋珍稀濒危动物数量及群落结构等进行查实。16.3调访与观测16.3.1技术要求与调查要素16.3.1.1技术要求以调访和观测等途径，对海洋珍稀濒危动物数量及群落结构等进行查实。任何观测手段或方法，都不应威胁到海洋珍稀濒危动物的生命安全。16.3.1.2调查要素儒艮、中华白海豚和斑海豹的数量；海龟和鲎的种类和数量；文昌鱼、白蝶贝等的分布、密度、生物量、年龄结构等；重点保护海鸟的数量、分布、种群组成等。16.3.2海洋珍稀濒危游泳动物调访与观测16.3.2.1仪器设备仪器设备应符合以下要求：a)望远镜(双筒：7×50;8×40;10×40或单筒);b)长镜头照相机；d)卫星定位仪(GPS);e)罗盘；f)海拔表；g)温度计；h)计数器。16.3.2.2站位布设在调查海域内均匀布设站位，一般每2km²布设一个观测站位。16.3.2.3调访手段与观测方式对儒艮、中华白海豚、斑海豹、海龟、鲎等海洋珍稀濒危游泳动物的调访以现场观测、摄像与照相为主，亦可采用卫星遥感、航空遥感、定点连续观测；目测个体的大小、性别、年龄、体重等特征，填写观测记录格式见表A.17和表A.18;在调查期间发现有违捕海洋珍稀濒危游泳动物的，调查人员应及时赶到现场，并会同有关海洋行政管理部门进行救治；对已死亡的海洋珍稀濒危游泳动物应制成标本。16.3.2.4样品分析与资料处理统计海洋珍稀濒危游泳动物在观测期间出现的机率，被违捕个体的生物学特征及死亡个体等，编制海洋珍稀游泳动物观测结果统计表(见表A.18)。16.3.3珍稀濒危海鸟类调访与观测16.3.3.1仪器设备见16.3.2.1.16.3.3.2调访手段与观测方式16.3.3.2.1站位布设原则珍稀濒危海鸟调访采用距离抽样的方法，具体包括样点法和样带法，两种方法的站位布设原则为：a)样点法观测站位以每观测区域布设20个左右站位，各站位间距应不小于200m;b)样带法观测以每观测区域布设4条～7条观测条带，各条带的直线距离不小于500m。16.3.3.2.2样点法步骤如下：a)确定调查区域内观测点，观察者在每个观测点等待至鸟类到达观测点并平静下来后开始计数，每一观测点计数3min～10min;b)每一观测点至少进行两次计数，一次在鸟类繁殖季节的前半部，一次在后半部；c)记录每个鸟种在每个观测点内出现的最大值，每一个观测点应用卫星定位仪进行定位。16.3.3.2.3样带法步骤如下：a)确定区域内观测样带，确定每样带调查观测次数；b)以步行、驾车、驾船、飞行等方式沿设计好的观测样带移动，记录向海一面的鸟类观测结果，包括海面或近岸陆上的鸟类和正在飞行的鸟类；c)记录移动速度和移动时间，计算样带面积(样带面积=移动速度×移动时间×目测样带宽度),记录单元可通过固定时间或固定距离获得；估算被记录鸟类距离观测者(样带)的距离；d)飞行中的鸟在10min内用几个瞬间快速调查计数，计数在300m宽(由船向外的垂直距离)和前方调查人员认为能够看见所有鸟的长度范围内进行；与船有联系的鸟(如跟着船走的鸟)可以另行记录或忽略不计。16.3.3.3样品分析与资料处理珍稀濒危海鸟类调查数据记录于表A.19和表A.20。采用样点法调查，应将日期、观测点坐标、生态环境、海拔高度、生境、观测起止时间以及观测到鸟类相关信息等记录于表A.19;采用样带法调查，应将日期、观测点坐标、生态环境、海拔高度、生境、观测起止时间以及观测到鸟类相关信息和与样带的垂直距离等记录于表A.20。16.3.4其他珍稀濒危海洋动物调访与观测(以文昌鱼为例)16.3.4.1仪器设备采用大型底栖生物采样设备(0.1m²箱式或抓斗式采泥器);负荷为1000kg绞车和吊杆；绞车用钢丝绳，一般为直径6mm～8mm的软钢丝绳；套筛(由3层不同孔径的筛子和支架组成，上层筛的孔径为2.0mm～5.0mm,中层为1.0mm,下层为0.1mm～0.5mm);游标卡尺；体视显微镜；电子天平(感量：0.01g);镊子等实验室常用物品。16.3.4.2站位布设根据文昌鱼分布情况布设站位。16.3.4.3样品采集文昌鱼样品使用采泥器采集，每个测站采样面积至少为0.1m²。样品用底层孔径为0.1mm的套筛分选，现场挑选出上层或中层筛子内的文昌鱼样品，放入标本瓶中。可将生物样及沉积物全部装入文昌鱼标本瓶中带回实验室再行处理。样品用体积比为5%～7%的中性甲醛溶液固定，样品瓶外贴好标签。样品采集站位、时间、水深、沉积物类型等信息记录于表A.21。16.3.4.4样品分析用游标卡尺测量每个采样站位30尾文昌鱼样品的体长(mm),少于30尾的站位则测量所有样品的体长(mm)。计算每个站位文昌鱼的总个体数，用总个体数除以采样面积，得到每个站位文昌鱼的栖息密度(ind/m²)。将文昌鱼样品放在吸水纸上吸去水分，称重，用文昌鱼的样品重量除以采样面积，得到每个站位文昌鱼的生物量(g/m²)。样品分析数据包括总个体数、栖息密度、总生物量、平均体长等信16.3.4.5样品保存文昌鱼标本经分析后，放入250mL白色广口瓶中，用70%的乙醇固定长期保存。16.3.4.6资料处理资料处理要求如下：a)绘制年龄结构图文昌鱼各年龄组的体长范围为：0龄≤7.0mm;7.0mm<I龄≤15.0mm;15.0mm<Ⅱ龄≤29.0mm;29.0mm<Ⅲ龄≤37.0mm;37.0mm<IN龄≤43.0mm;V龄以上>43.0mm。部分海域分布的文昌鱼由于水温、种群等差异，各年龄组体长范围有所差异。根据体长分布规律确定不同年龄组体长范围。将所有站位样品体长数据作为一个样本群，作出年龄结构图(见图3).b)绘制密度及生物量平面分布图采用等值线或圆圈绘制出密度及生物量的平面分布图，密度区间为<50,≥50～<100,≥100～<200,≥200～<400,≥400～<800,≥800,单位为尾每平方米(ind/m²)。生物量区间为<5,≥5～<10,≥10～<20,≥20～<40,≥40～<80,≥80,单位为克每平方米(g/m²)。图3文昌鱼年龄结构模式图17滨海湿地植物——野外勘查法本方法适用于滨海湿地植物的野外调查。以布设断面和选择样地等方法，对滨海湿地植物密度、频度、生长高度和地上生物量进行调查。17.3湿地植物样地设置与描述17.3.1样地设置的原则样地设置的原则如下：a)典型性和代表性原则：样地要有较好的代表性，有限的调查面积中应较好地反映出植物群落的基本特征，不应在两个群落的过渡带上设置样方。样地地形相对平坦，地势布相对均匀。b)自然性原则：选择人为干扰和动物活动影响相对较少的地段，且样地在较长时间不被破坏，如c)充分性原则：样地内或样地外有足够的植物供取样分析，以及土壤水分观测，土于气象观测或资料的收集等。对固定样地应进行围栏、封育，围栏面积应大于观测样地的实际d)安全性原则：在进行植物及其群落调查与采样时，应选择对湿地生态系统破坏较小的观测方法。观测区设置应具有合理性，减少观测活动对综合观测场生态环境的干扰，保证观测位点的e)定位原则：永久样地应有明显标识物，可通过打桩或GPS定位。描述内容见表3。表3植物群落样地描述调查表断面号人类活动自然灾害b)样地选择和面积确定：随机选择样方3个～5个，草本群落样方面积宜取1m×1m,灌丛群落宜取3m×4m;某种植物在全部调查样方中出现的百分率。)b)样地选择和面积确定：随机选择样方3个～5个，草本群落样方面积宜取1m×1m,灌丛群落宜取3m×4m;17.6.1.2调查方法b)样地选择和面积确定：随机选择样方3个～5个，草本群落样方面积取1m×1m,灌丛群落取 17.7.1.2调查方法调查方法如下：b)样地选择和面积确定：随机选择样方3个～5个，样方面积为1m×1m,每期重复5个样方；c)生物量确定：采用收获法测定草本植物群落地上绿色部分、已枯部分和凋落物的干重之和。分种收获样方内植物群落的地上部分，应将植物齐地面剪下，并将绿色部分、已枯部分和凋落物部分和凋落物分别称其鲜重后，放入大小适当的纸袋中，置于鼓风干燥箱内85℃烘干至恒重，18腹泻性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA)按《海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查》的要求执行。19麻痹性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA)按《海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查》的要求执行。20麻痹性贝毒——高效液相法(HPLC)20.1适用范围本方法适用于海洋贝类生物体中麻痹性贝毒的检测。海洋贝类生物体内的麻痹性贝毒经分离提取后，通过碱性氧化作用将毒素分子氧化成有色的荧光衍生物，再通过高效液相色谱荧光检测系统进行检测。仪器设备应符合以下要求：b)色谱柱：C₈反相柱(4.6mm×250mm,5μm),或与之相当者；c)高速离心机，转速不低于12000r/min;d)旋涡振荡器；e)真空泵；f)酸度计。20.4试剂及其配制试剂及其配制要求如下：d)四丁基磷酸铵溶液(1.2mmol/L):0.20g四丁基磷酸铵溶解于450mL水中，用氨水调整pH值为6.5,以水准确定容至500mL,过0.45μm水相滤膜；e)1-庚烷磺酸钠(2.6mmol/L)与磷酸铵(10mmol/L)混合溶液：0.26gl-庚烷磺酸钠和1.02g磷酸铵溶解于450mL水中，用乙酸和氨水调整pH值为7.1,以水准确定容至500mL,过f)高碘酸(7mmol/L)与磷酸钾(50mmol/L)混合溶液：0.80g高碘酸和6.66g磷酸钾溶解于450mL水中，用乙酸和氨水调整pH值为9.0,以水准确定容至500mL;g)乙酸水溶液(0.5mol/L):14.31mL乙酸，用水定容至500mL;h)麻痹性贝毒标准溶液：标准母液可用乙酸(0.01mol/L)稀释配制标准使用液，冷冻避光保存(不应超过1年);i)水：试验用水均为超纯水。20.5样品采集与保存20.5.1采样原则样品采集的原则是：样品新鲜，样品的分布具有代表性；同种样品的个体体长大致相似；样品带壳外观正常，采集后及时冷冻保存。20.5.2采样数量宜采集贝类1kg～2kg.20.5.3样品保存采集的新鲜样品保存或运输过程中应冷冻，不应放于水中。20.6分析步骤20.6.1仪器工作条件20.6.1.1高效液相色谱仪工作条件高效液相色谱仪的工作条件如下：a)实验室温度为20℃~27℃,温度变化小于3℃/h,相对湿度小于80%;c)流动相：检测C1～C2毒素时流动相为四丁基磷酸铵；检测GTX1-GTX5、dcGTX2和dcGTX3毒素时流动相为1-庚烷磺酸钠与磷酸铵的混合溶液；检测STX、neoSTX和dcSTX毒素时流动相为1-庚烷磺酸钠与磷酸铵混合溶液：乙腈(体积比20:1);e)荧光波长：λ=330nm,λm=390nm;f)进样量：10μL或根据样品含量适当增减；g)数据处理：峰面积外标法定量。20.6.1.2柱后衍生仪工作条件柱后衍生仪工作条件如下：a)实验室温度为20℃~27℃,温度变化小于3℃/h,相对湿度小于80%;b)柱后衍生剂1:高碘酸与磷酸钾混合溶液；c)反应器1:75℃,2.0mL;d)柱后衍生剂2:乙酸水溶液；e)反应器2:30℃,0.1mL;搅拌；用5mol/L盐酸调节pH值为2.0～4.0,加热煮沸5min,冷却至室温；用超纯水定容至30mL,5mol/L盐酸调节pH值为2.0～4.0(pH值不应大于4.5),12000r/min,离心10min,0.22μm水相方法检出限见表4。表4各类麻痹性贝毒检出限参考表毒素类型 (22)在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。a)每批次样品测试完毕后，应根据仪器特征用超纯水和甲醇或乙腈充分清洗系统，防止盐类析出结晶；b)所用试剂不可放置时间过长，宜即用即配，发现有沉淀生成应过滤使用或抛弃处理。21记忆缺失性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA)按《海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查》的要求执行。22神经性贝毒——酶联免疫吸附试验法(ELISA)按《海洋灾害调查技术规范第3部分：海洋生态灾害调查》的要求执行。23金黄色葡萄球菌——测试片法23.1适用范围本方法适用于海洋鱼、虾、蟹、贝、藻类等生物样品中金黄色葡萄球菌的快速检验计数。本方法包括直接计数法与MPN计数法，当两种方法所获得的结果发生矛盾时，以直接计数法为仲裁方法。23.2直接计数法23.2.1方法原理金黄色葡萄球菌快速检验测试片法，是一种不需准备培养基、应用一种预先制备好的快速检验系统(测试片)来检测金黄色葡萄球菌的方法。测试片含有具有显色功能并经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌具有很强的选择性，培养24h后金黄色葡萄球菌在测试片上形成紫红色菌落。当测试片上出现除紫红色以外的其他任何颜色的菌落时，则应使用确认反应片。此确认反应片含有显色剂和脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid,简称DNA)。金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶(DNase)会和反应片中的显色剂形成粉红色晕圈。23.2.2仪器设备仪器设备应符合以下要求：a)超净工作台；c)冰箱，2℃~5℃;d)高压蒸汽灭菌器；e)便携式冷藏箱；f)天平或电子称：感量0.1g;g)移液器及其吸头或无菌吸管1mL、10mL;h)无菌锥形瓶：150mL;i)无菌培养皿：直径90mm;j)无菌试管：180mm×18mm;k)干热灭菌箱；m)灭菌玻璃研钵或均质器(旋刀式或拍击式);n)放大镜或菌落计数器；o)金黄色葡萄球菌测试片压板；p)酸度计或精密pH试纸；r)一次性无菌乳胶手套；s)一次性无菌塑料袋；u)集网箱养殖鱼类、甲壳类的手捞网；v)采样记录表格。23.2.3试剂和测试片所需试剂和测试片如下：b)金黄色葡萄球菌测试片(应符合23.2.1方法原理的要求);c)金黄色葡萄球菌确认反应片(应符合23.2.1方法原理的要求)。23.2.4样品采集与预处理见8.2.4.3。23.2.5检验操作程序检验操作程序见图4。图4金黄色葡萄球菌测试片直接计数法检验程序23.2.6接种和培养接种和培养步骤：a)接种：取2个～3个稀释度(10-1、10-²、10-3)样品稀释液接种金黄色葡萄球菌测试片上，每个稀释样品接种3片，每片1mL。将测试片置于超净工作台上，揭开上层膜，用移液器吸取1mL样液垂直滴加到一张测试片的中央处，然后将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生，再把金黄色葡萄球菌的压板放置在上层膜中央处，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面上，拿起压板，静置至少1min使培养基凝固；b)培养：将测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，堆叠片数不应超过20片，在36℃±1℃条件下培养24h±2h;c)确认反应：如上述测试片上没有菌落生长或菌落全部是紫红色(典型的金黄色葡萄球菌特征),无需进行确认；如测试片上出现黑色菌落、蓝绿色菌落或紫红色菌落不明显，应使用确认反应片作进一步确认；d)将上层膜掀起，将确认反应片置入测试片的培养范围内，再将上层膜放下覆盖在确认反应片上，用手指以滑动的方式轻轻将测试片与确认反应片压紧，包括确认反应片的边缘，此步骤可使测试片与确认反应片紧密接触并除去气泡，最后把插入确认反应片的测试片放在36℃±1℃的培养箱内培养1h～3h。23.2.7菌落计数与报告菌落计数与报告要求如下：a)判读：紫红色的菌落直接计数为金黄色葡萄球菌；需要使用确认反应片作确认时，计数有粉红色晕圈的菌落。没有粉红色晕圈的菌落不是金黄色葡萄球菌，不应被计数。如整个培养面积呈粉红色而没有明显的晕圈，说明金黄色葡萄球菌大量存在，结果记录为“多不可计”;b)菌落计数与报告：培养结束后立即计数，可目视或用菌落计数器来计数，放大镜可辅助计数；选取金黄色葡萄球菌菌落数在15～150之间的测试片，计数菌落平均数，乘以相对应的稀释倍数，即为每克样品中的金黄色葡萄球菌数，报告单位以“CFU/g”表示；c)如所有稀释度测试片上的菌落数都小于15,则计数稀释度最低的测试片上的菌落平均数乘以稀释倍数作报告；如所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数作报告；如最高稀释度的菌落数大于150个时，计数最高稀释度的测试片上的菌落平均数乘以稀释倍数作报告。23.3MPN计数法23.3.1检验程序检验程序见图5。23.3.2样品采集与预处理见8.2.4.3.23.3.3样品稀释液接种、培养与确认见23.2.6。23.3.4结果判读与报告金黄色葡萄球菌菌落判读见23.2.7a),根据金黄色葡萄球菌阳性测试片数，查MPN检索表(见附录C),报告每克或每升样品中金黄色葡萄球菌MPN值。如可以直接计数的，结果报告见23.2.7b)。报告结果图5金黄色葡萄球菌测试片MPN计数法检验程序23.4废弃物处理与生物安全措施见8.4.24沙门氏菌——微孔板试剂盒法24.1适用范围本方法适用于海洋鱼、虾、蟹、贝、藻类等生物样品中沙门氏菌的快速检验。24.2方法原理沙门氏菌微孔板试剂盒快速检验法