HYT 151-2013 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法

海洋微藻中溶血毒素的检测血细胞法Detectionofhemolytictoxinsinmarinemicroalgae—Erythrocytelysis2013-04-25发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局南海环境监测中心提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本标准起草单位：国家海洋局南海环境监测中心、暨南大学。1海洋微藻中溶血毒素的检测血细胞法1范围本标准规定了用血细胞法检测海洋微藻中溶血毒素活性的方法及技术要求。本标准适用于自然海水中海洋微藻细胞中溶血毒素的检测，也适用于实验室培养的海洋微藻细胞中溶血毒素的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB17378.3—2007海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输HY/T069—2005赤潮监测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。海水中粒径大于2μm的浮游植物。一类主要由微藻产生能够导致机体红细胞及其他真核细胞裂解的糖脂类物质，其主要作用于敏感细胞的细胞膜脂质部分。溶血毒素溶解血细胞的效力。用来表述溶血毒素活性的量纲。1个溶血单位相当于在1mL反应系统中(含柠檬酸缓冲液0.15mL、0.5%的兔血红细胞0.80mL和溶血毒素粗提液0.05mL),在37℃水浴30min使红细胞溶解50%时所需溶血毒素的量，相当于(1.30±0.39)μg洋地黄皂苷。血细胞法erythrocytelysis针对溶血毒素破坏、溶解血细胞的特性建立的一种检测方法，该方法以溶血单位为量纲来定量溶血毒素的溶血活性。微藻细胞浓度达到或超过HY/T069—2005规定的基准浓度的海水样品。2微藻细胞浓度未达到HY/T069—2005规定的基准浓度的海水样品。4原理利用氯仿、甲醇和水体积比为13:7:5的提取液萃取微藻细胞中的溶血毒素，经减压蒸馏浓缩后，再以甲醇溶液溶解残留物，得溶血毒素粗提物；用粗提物溶解血细胞，同时配置洋地黄皂苷标准系列溶液绘制工作曲线，结合粗提物的溶血情况计算溶血毒素的活性。5试剂和材料除非另作说明，本标准所用试剂均为分析纯，水是蒸馏水或者等效纯水。5.1氯仿(CHCl₃)。5.3柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)。5.4洋地黄皂苷(C₅₆H₉₂Oz,99%)。5.5氯化钠(NaCl)。5.6柠檬酸钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)。5.7葡萄糖(C₆H₁₂O₆)。5.8曲拉通X-100(C₃₄H₂O₁)。5.9医用肝素钠注射液[(C₂H₁₆NS₂Nag)2o,5000IU/mL]。5.10提取液：氯仿、甲醇和水体积比为13:7:5。5.11柠檬酸溶液(2mol/L):称取柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)42.0g,置于200mL烧杯中，用水溶解后5.12洋地黄皂苷母液(10μg/mL):称取洋地黄皂苷1.0mg,置于200mL烧杯中加水搅拌至溶解(必5.13柠檬酸缓冲液：称取0.8532g氯化钠(NaCl),2.1680g柠檬酸钠(C₀H₅Na₂O₇·2H₂O),4.5180g葡萄糖(C₆H₁₂O₆),置于500mL烧杯中，用水溶解，用柠檬酸溶液(5.11)调pH值至7.0,移入250mL5.14兔血红细胞溶液(0.5%,体积比):取健康新西兰兔新鲜血液10mL,加入微量医用肝素钠注射液，以1200r/min的转速离心10min,弃上清液，加入柠檬酸缓冲液(5.13),轻轻摇匀后再次同条件离心，去上清液，反复三遍，直到上清液无色，根据离心后血细胞体积，用柠檬酸缓冲液(5.13)配成0.5%6仪器设备6.1分光光度计：需有540nm的吸收波段。6.3超声波细胞粉碎仪：配直径为2mm的变幅杆，超声功率可达200W。6.4天平：感量0.1g。6.5分析天平：感量0.1mg。6.6光学显微镜：配有可放大倍数为40倍、100倍的物镜和目镜。36.14过滤器：滤头直径60mm,配250mL滤杯，1000mL滤瓶。样品宜立即在3000r/min的转速下离心10min,或用孔径为0.45μm的纤维素酯微孔滤膜过滤音箱内，超声功率调为200W,超声时间为5s,间隔时间为6s,工作时间为20min,取微量破碎液在显8分析步骤8.1.1将八支10mL离心管洗净，后用水润洗三遍后，放置于烘箱内80℃干燥20min,取出冷却照(全溶血)。分别取摇匀后的0.5%兔血红细胞溶液(5.14)1.60mL,依次加入上述离心管中。8.1.2所有离心管置于37℃水浴锅内，30min后取出，以800r/min的转速离心10min,取上清液，用分光光度计在波长540nm处检测吸光度值A;,阴性对照吸光度值为A。,阳性对照吸光度值为A.。4式中：P;——工作曲线溶血百分数；A;——洋地黄皂苷母液作用于血细胞后的吸光值；A₀——阴性对照的吸光值；A.——阳性对照的吸光值。8.2样品测定8.2.1空白对照测定：取10mL离心管，置于冰上，加入0.10mL甲醇、0.30mL柠檬酸缓冲液(5.13)和1.60mL0.5%的兔血红细胞溶液(5.14,吸取前应摇匀),置于37℃水浴锅内，反应30min后取出，立即以800r/min的转速离心10min,取上清液，用分光光度计在波长540nm处检测其吸光度值Ato,Aw为空白对照1的吸光值。取10mL离心管，置于冰上，加入0.10mL毒素粗提物和1.90mL柠檬酸缓冲液(5.13),置于37℃水浴锅内，反应30min后取出，立即以800r/min的转速离心10min,取上清液，用分光光度计在波长540nm处检测其吸光度值A,w,A,w为空白对照2的吸光值。8.2.2样品测定：取10mL离心管，置于冰上，加入0.10mL毒素粗提物、0.30mL柠檬酸缓冲液(5.13)和1.60mL0.5%的兔血红细胞溶液(5.14,吸取前应摇匀),置于37℃水浴锅内，反应30min后取出，立即以800r/min的转速离心10min,取上清液，用分光光度计在波长540nm处检测其吸光度值A。,A。为测试样品的吸光值。8.2.3当样品溶血后的吸光值大于或等于阳性对照(全溶血)的吸光值时，毒素粗提物样品用甲醇稀释后按照8.2.1测试。8.3数据记录将测得的相应数据记入表A.2中。9结果计算按照式(2)计算样品溶血百分数(Pa)。 (2)P。——样品溶血百分数；A。——测试样品的吸光值；Aw——为空白对照1的吸光值；Aw——为空白对照2的吸光值。由工作曲线查得P。相当于洋地黄皂苷的量m,按照式(3)计算溶血活性(HA)。 (3)m——工作曲线中洋地黄皂苷的量，单位为微克(μg);ED₅₀——当P;为50%时的洋地黄皂苷的量，单位为微克(μg);5V——浓缩前样品的体积，单位为升(L);10精密度与准确度当样品中溶血毒素的溶血活性为230HU/L时，6家实验室对同一批样品进行测定，重复性相对标准偏差为2.77%,再现性相对标准偏差为22.4%。6(规范性附录)检测过程中所用记录表的格式表A.1所示为检测工作曲线的数据记录表。表A.2所示为样品检测记录表。表A.1海洋微藻中溶血毒素的检测工作曲线数据记录(血细胞法)吸光值编号曲拉通X-10001234567洋地黄皂苷母液浓度/(pg/mL)表A.2海洋微藻中溶血毒素的检测样品检测记录(血细胞法)样品溶血百分数(Pa)[1]彭喜春.球形棕囊藻溶血毒素及其生物合成机制的研究[D].广州：华南理工大学轻工与食品学院，2005:10-60.[2]商文.球形棕囊藻对几种海洋生物的毒性效应研究[D].广州：暨南大学，2006:14-22.[3]宋秀凯.鱼腥藻溶血素分泌的理化条件及溶血作用研究[D].青岛：中国海洋大学，2005:[4]周成旭，傅永静，严小军.4种典型有害赤潮原因种的溶血特性研究[J].生态毒理学报.2007,2(1):78-82.[5]何家菀，陈明惠，何振容.小定鞭藻毒素的分离与鉴定[J].水生生物学报.1996,20(1):41-48.[6]何家菀，施之新，张银华，等.一种棕囊藻的形态特征与毒素分析[J].海洋与湖沼.1999,30[7]崔伟民，杨维东，刘洁生，等.米氏凯伦藻溶血毒素的溶血反应特征[J].2009,17(3):237-24.[8]TatumNeely,LisaCampbell.AmodifiedassaytomongKareniaclonesisolatedfromtheGulfofMexico[J].HarmfulAlgae.2006,5:592-598.[9]M.KarindeBoer,MonikaR.Tyl,MengFibrocapsajaponica(Raphid