电镜生物技术方法

电镜生物技术方法与细胞超微结构E-mail：woodzs@163.com2011.9.23电镜在生物医学中的应用电子显微镜和生物样品制备技术的发展和应用，不仅揭示了生物细胞中各种细胞器的超微平面和立体结构，而且做到了对生物大分子，特别是核酸、蛋白质、酶、抗原和受体等在超微结构中的准确定位、定性和定量。目前，电镜技术的应用已远远超出细胞学、组织学、病理学和微生物学的范畴，向细胞生物学、分子生物学、分子遗传学、生理和药理等学科扩展，成为生物学、基础医学与临床医学等领域的重要研究手段。

电镜的缺点观察范围小，价格高；电子束辐射损伤；图像分析困难；制样技术限制；制样技术决定了样品的结构和反差，目前已有的制样技术中最佳分辨率也仅在2~3nm，还无法与电镜的高分辨能力相匹配。样品制备的目的1.获得足够薄的样品，以利于电子束穿过；2.脱水，减少水分子对真空系统的破坏；3.固定，保存细胞的超微结构电镜生物样品制备方法分类

TEM样品制备法超薄切片负染电镜细胞化学免疫电镜冷冻技术X射线微区分析扫描电镜制样技术SEM样品制备法一.超薄切片技术超薄切片技术(TheTechniquesofUhrathinSection)是透射电镜生物样品制备技术中最重要、最基本、最常用的技术。操作流程：取材→固定→脱水→浸透→包埋→聚合→修快→半薄切片→染色→定位→超薄切片→染色→观察超薄切片制作流程1.取材取材是超薄切片制备的第一步，组织结构是否保存完好直接关系到实验结果的可靠性，因此是非常关键的一步。首先将组织剪切成1mm3大小的组织块，迅速投入3%戊二醛（4℃）中固定。取材过程中要求动作迅速准确，组织块不能过大，并尽量在低温下操作。2.固定

目的:是防止细胞自溶，稳定细胞成分，较好的保存组织细胞的超微结构固定剂的作用:与某些蛋白质、脂质等生物大分子发生交联，迄今尚未发现能够对细胞内所有活性物质起固定作用的全能固定剂，因此目前常采用戊二醛-四氧化锇双固定的方法。戊二醛能够较好的保存糖原、核糖体，对微管及内质网等细胞膜系统和细胞基质有良好的固定作用；四氧化锇对蛋白质、脂肪、脂蛋白和核蛋白固定效果较好，对样品有较强的电子染色作用，能增强图像反差。其他还包括甲醛、多聚甲醛、高锰酸钾等。常用固定剂戊二醛：能与蛋白质分子的氨基和肽键连接形成交联，能够较好的保存糖原、核糖体，对微管及内质网等细胞膜系统和细胞基质有良好的固定作用；特点是渗透快、能良好地保存结构、使用条件较随意，因而适用范围广。商品戊二醛呈浅黄色，pH4.5～5.0，最好在4℃条件下避光保存。当戊二醛的颜色变至深黄，pH降至3.5以下时，说明已失效，不宜再用。为了维持样品的生理渗透压，使用戊二醛时常用缓冲液配制成2％～3％，但对于有特殊要求的样品，可以在1%～5%之间选择。建议最好在临用之前配制新鲜的固定液，以提高效力。戊二醛用戊二醛固定时，一般以4℃为宜，固定的时间短可几分钟至几十分钟，长可达几日，甚至数周，所以常用于样品的前固定、临床病理速检固定和野外作业固定等。戊二醛除了对保持细胞的细微结构良好之外，还能保存某些酶的活性。因此经戊二醛固定的材料(但固定剂的浓度要低)，也可以用来做组织化学方面的测定。但如果做形态组织结构方面的电镜观察，那么通常在用戊二醛固定之后，接着再用1—2％的锇酸重复固定0.5一2小时。但在固定之前，一定要把残留在细胞内的微量戊二醛洗干净，因为戊二醛和锇酸会起反应，形成黑色沉淀，毁坏样品的影象。常用固定剂四氧化锇：又称锇酸，对蛋白质、脂肪、脂蛋白和核蛋白固定效果较好，对样品有较强的电子染色作用，能增强图像反差。渗透速率较醛类要慢得多，所以常用于后固定，并且在固定之前必须把样品切成小于lmm3的块状。四氧化锇对皮肤和粘膜有刺激作用，操作时要格外小心，最好使用通风橱，并戴防护手套。一般配制1％的四氧化锇固定液1.组织：切成1mm3大小，3%戊二醛4℃固定2小时；2.细胞：106以上的细胞，尖底离心管，1000转/min离心10min，将3%戊二醛沿管壁缓缓加入，防止冲散细胞团，4℃固定2小时固定良好的细胞超微结构的形态特征

细胞器

形态特征细胞质膜三层结构清晰，没有断裂，层间隙基本均匀细胞质基质微粒均匀密布，没有空白区域粗面内质网腔呈扁平状，上面附着核糖核蛋白体颗粒线粒体外周双层膜和内嵴完整，无膨胀和收缩，基质致密，无空白区域细胞核双层膜完整，显示核膜孔，膜间隙均匀，核染色质浓密，3.脱水

目的：含水的生物样品放入电镜高真空时，样品会急骤收缩并产生水蒸气，严重破坏镜筒高真空环境，造成镜筒污染；电镜常用的包埋介质绝大多数不溶于水。具体的脱水程序为：

50％乙醇5～10分钟；

70％乙醇5～10分钟；

90％乙醇5～10分钟；

90％乙醇＋90％丙酮（1：1）5～10分钟；

90％丙酮5～10分钟；

100％丙酮10～15分钟；以上步骤均在4℃进行100％丙酮10～15分钟（在室温进行）；4.包埋与聚合

目的：利用包埋剂逐步取代组织细胞中的脱水剂，并在高温下聚合成适宜机械切割的包埋块。包埋剂能对样品内各种结构进行坚固的支持，使其能承受切割和耐受电子束的轰击。常用包埋剂包括树脂618、Epon812和Spurr，其中Epon812由于渗入组织较快，折光性较好，聚合块硬度适中等特点应用较广。高温聚合时一般采用温度梯度聚合，35℃，12小时；45℃，12小时；60℃，24小时。包埋板包埋块5.超薄切片

超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术，利用超薄切片机可以将包埋好的样品切制成70nm厚度的切片，放置于附着薄膜的铜网上。超薄切片刀包括钻石刀和玻璃刀两种，前者硬度大耐用但价格昂贵，后者刀刃较脆不耐用，但价格低廉。超薄切片机钻石刀载网载网是用来支持切片的金属网，包括铜网、镍网、银网及不锈钢网等，常用规格为230目的铜网。支持膜支持膜是一种能支持观察样品的薄膜，厚度约20nm。性能良好的应具备高透明度，在电镜下无可见结构，与所支持的各种样品不产生化学反应常用支持膜：formar、碳膜、火棉胶基底碳膜、微筛膜和单孔及大孔铜网制模等铜网6.电子染色

由于透射电镜是根据电子束照射到样品后，样品各部分散射电子的多少来成象的，而生物组织是由碳、氢、氧、氮等轻元素所组成，散射电子能力较弱，未经染色的片子电镜下反差很弱，难以看清微细结构。目前常采用醋酸铀-柠檬酸铅双染法。染色的目的让被分析样品结合上一些重金属，以增加其反射电子的能力，使样品成像的衬度变大，最终获得高质量的电镜照片。目前常采用醋酸铀-柠檬酸铅双染法。常规超薄切片技术流程取材：组织1mm×1mm×1mm前固定：3%戊二醛固定液（1/15MPBSpH7.2-7.4）2小时4℃清洗：1/15MPBS+0.19M蔗糖缓冲液pH7.2-7.42小时或过夜4℃后固定：1%OsO4固定液（0.24MPBSpH7.2-7.4）2小时4℃系列乙醇、丙酮脱水：50、70、90、100%10—15分钟/次4℃浸透、包埋：Epon812/环氧树脂618/水溶性树脂聚合：35℃、45℃各12小时；60℃24小时超薄切片：切片厚度60—70nm重金属染色：醋酸双氧铀5-10分钟；柠檬酸铅5分钟二．负染技术负染又称阴性反差染色，它是利用高密度的重金属盐（如磷钨酸）包围生物细胞，在暗背景中显示出细胞的超微结构。负染图像正好与超薄切片正染色相反，细胞结构呈透明浅色，而背底为黑色或灰色。该法操作简单、快速、省时、分辨力较高，广泛应用于生物大分子观察，病毒、细菌等快速诊断工作中。染色原理制备方法1.制备悬浮液；2.将悬液滴加到带有支持膜的铜网上；3.染色：0.5-3%磷钨酸（PTA）（水溶液或磷酸缓冲液）pH6.4—7.0染色1-2分钟。注意事项1.pH值：略偏酸对病毒负染的效果较好。2.样品的纯度和浓度：杂质多对染色产生干扰；浓度高样品成堆影响观察；浓度低寻找样品困难。3.样品的均匀性：由于火棉胶膜是疏水膜，样品在膜上易凝聚成团块，无法观察微细结构。用0.01%BSA稀释可以加强扩散作用。三、冷冻技术电镜生物样品常规制样中，各种化学固定剂对细胞成分的固定是有选择性的，易造成某些可溶性成分和部分生物大分子的丢失和重新分布，在很大程度上限制了它在细胞化学、免疫细胞化学及X射线微区分析等研究中的应用。脱水对样品的影响常规制样与冷冻制样对比采用低温固定法使样品中的水以固态形式存在或去除。优点：快速冷冻固定速度比化学固定快约1000倍，可以在极短时间内固定组织，将自溶减少到最低；冷冻固定可以较好地保存组织细胞内的抗原和酶的活性，是免疫电镜细胞化学最佳方法；冷冻固定不会引起细胞内化学成分的改变，使可溶性及游离性元素不发生丢失和移位，是进行细胞内X-射线微区分析的最佳方法；常规制样方法经固定剂和脱水剂处理后样品收缩，而冷冻技术能避免细胞变形满足形态学完美的要求。冷冻技术主要包括冷冻超薄切片、冷冻蚀刻和冷冻置换技术。1.冷冻超薄切片技术1952年Fernandez和Moran首先采用该技术方法。经不断改进和完善，特别是80年代以后国内引进了该技术，从而推动了我国的电镜细胞化学、免疫电镜细胞化学、X-射线微区分析等研究工作的进展。冷冻超薄切片技术是用快速冷冻固定取代或减少化学固定，取消了有机溶剂脱水、树脂浸透、包埋等步骤分类1.样品不经过任何处理直接冷冻固定，然后进行超薄切片，适用于橡胶、塑料等弹性材料和高分子材料，以及生物材料中进行放射自显影和X射线微区分析的样品；2.醛固定和冷冻保护剂处理，然后进行冷冻固定和超薄切片，适用于进行形态学研究和细胞化学、免疫化学研究。组织：1×1×1mm3悬液滴固定：2.5%戊二醛固定液或戊二醛﹢多聚甲醛固定液清洗：相应的缓冲液冷冻保护3%甘油、蔗糖、二甲基亚砜、5%PVP快速冷冻固定：KF80或MM80E冷冻超薄切片80～100nm样品温度-100～-110℃刀温度-80～-90℃捞片：饱和蔗糖滴清洗：蒸馏水电镜细胞化学染色电镜免疫细胞化学染色TEM观察形态学电镜细胞化学免疫电镜细胞化学重金属染色冷冻干燥TEM观察微量元素分析形态学冷冻超薄切片技术2.冷冻蚀刻技术利用在冷冻条件下样品变得又脆又硬时，用刀劈裂样品，断裂常发生在细胞冷冻后较脆弱的部位，多数情况下沿细胞及细胞器的膜裂开；它既可以在扫描电镜下观察三维立体结构，又可以在断裂后做超薄切片在透射电镜下观察二维平面结构，还可以做冷冻断裂免疫电镜技术。操作程序：冷冻断裂→蚀刻→复型特点该技术能得到膜内部和细胞内部的三维结构像，是研究生物膜大分子结构、细胞连接装置和细胞骨架等结构的有力工具和手段。它还可以与免疫金标记技术相结合产生冷冻断裂标记技术，从而能够显示细胞膜表面大分子物质，如受体、抗体以及其它化学基团的分布情况。该技术样品制备周期短，还具有分辨力高、断裂面凹凸不平，立体感强、图象清晰、复型膜能耐受电子束轰击和便于长期保存的优点。冷冻断裂冷冻蚀刻在真空中使样品表面的冰升华，暴露出断裂面上细胞的超微结构。最佳蚀刻深度30nm，深度不够，超微结构没有充分暴露，观察时图像模糊；深度过大，超微结构与基础高低相差悬殊，因支持力不足容易倒塌。真空，-100℃冷冻复型采用电子透明的薄膜将样品表面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就相当于表面结构的一个“模子”，称为复型。特点：制样简便，不损伤样品，图像立体感强。常采用45°角喷铂，90°角喷碳制备方法取材：1mm×1mm×3mm固定：1-3%戊二醛固定液2小时4℃清洗：1/15MPBS(pH7.2-7.4)冷冻保护：30%甘油-生理盐水12小时4℃冷冻固定：样品放入LN2中冷冻断裂：高真空1×10–5Torr，样品升温到-100—-110℃蚀刻：继续升温到–90—-100℃，样品表面冰升华碳-铂复型膜：喷铂45°角1次喷碳90°角3-5次腐蚀：次氯酸钠溶液腐蚀样品清洗和捞膜：蒸馏水清洗两次复型膜并捞膜到400目铜网上心肌细胞膜上的钙离子通道脂滴与内质网3.冷冻置换技术在低温条件下，使生物样品中结成冰的水分逐步被有机溶剂取代以达到脱水的目的。它既可以保存细胞生活状态时的良好超微结构，又可以满足免疫电镜细胞化学和细胞X-射线微区分析的要求。冷冻置换后的样品可以常规包埋，也可经临界点干燥处理，喷镀后作扫描电镜观察。置换液：丙酮、OSO4

、戊二醛、甲醇等有机溶剂置换温度和时间：-90℃48小时-30℃3小时0℃升温速率：5℃/小时四.电镜细胞化学技术通过酶的特异细胞化学反应显示酶在细胞内的定位的电镜细胞化学称电镜酶细胞化学。利用各种化学和物理方法，使细胞内各种成分在原位形成电子密度大的、可见的最终产物，即金属沉淀物，然后借助电子显微镜进行观察分析。电镜细胞化学技术可以显示的酶多属水解酶、氧化还原酶和转移酶。目前，在细胞超微结构上能够定位的酶约有80多种。基本方法取材——组织切成1mm×1mm×2mm固定——2%戊二醛（二甲砷酸钠缓冲液）pH7.2-7.4/戊二醛+多聚甲醛漂洗组织——0.01M二甲砷酸钠缓冲液pH7.44℃2小时或过夜预切片——振动切片、冷冻切片、恒温切片切片厚度20—40um预孵——切片浸入无底物的孵育液中20℃18-24小时孵育——切片放入孵育液中，在恒温水浴箱中孵育。孵育时间和温度，根据不同反应来确定。漂洗——孵育液的缓冲液洗2—3次，每次5分钟，再用0.01M二甲砷酸钠缓冲液洗2—3次，4℃。后固定——1%OsO44℃1小时脱水、包埋、切片和染色——均按常规超薄切片法制备样品。冷冻超薄切片和冷冻置换法也可以进行电镜细胞化学。五.免疫电镜技术

Singer在1959年首先建立铁蛋白标记技术，开创了免疫电镜技术。1968年Nakane首先将免疫酶标记抗体技术应用于电子显微镜。该技术利用抗原抗体特异性结合的原理，在超微水平精确定位、定性和半定量。1971年Faulk等将胶体金标记抗体技术应用到电镜中，开始了胶体金标记免疫电镜技术。该技术的优点是：胶体金颗粒致密，易于辨认，定位比酶记标反应物更精确，同时还可以做定量分析；根据金颗粒各种大小不同直径（3-150nm），可以在同一切片上分别标记不同的抗体做双标记或多标记。Antigen1stantibody2ndantibodylabel2ndantibodylabel

免疫电镜胶体金标记法可以分为包埋前法和包埋后法。包埋前法是标记细胞表面抗原，样品先与一抗、二抗结合，然后再按常规超薄切片术进行生物样品的脱水、包埋和切片；包埋后法的操作程序与其正相反，主要标记细胞内各种细胞器上的抗原。胶体金标记免疫电镜技术还可以用到冷冻超薄切片、冷冻置换、冷冻蚀刻和扫描电镜样品制备中。六.X射线微区分析该技术属于分析电镜技术。它的特点是在电镜观察样品超微结构的同时，还可以分析微小区域内的化学元素。它的原理是电镜内高速细电子束轰击样品表面的微小区域，使该区域所含元素发射一定波长的X射线，通过检测发射的X射线波长和强度，便可了解该微小区域内所含元素的种类及含量。样品制备方法有常规透射、扫描电镜样品制备法；冷冻制样法包括冷冻超薄切片、冷冻置换及冷冻干燥法。优点在电镜下进行形态观察的同时，能对一定结构内的元素进行测定，从而获知超微结构变化与其组成元素变化的关系。可在不破坏样品的结构和保持各种元素原有分布的情况下进行分析。分析技术较为灵敏，可分辨小于1µm区域内质量约10克元素，分析面积可小至100-200nm。七.扫描电镜生物样品制备

1935年第一台扫描电子显微镜诞生。扫描电镜的原理是：在真空下电子经电子光学系统形成极细的电子束,照射并聚焦于样品表面上产生二次电子信号，二次电子的多少，随入射样品表面的凹凸状态而变化，经二次电子检测器收集二次电子信号，变成显像管的图象信号。由于SEM景深长，其图像层次丰富，立体感强，可观察生物样品表面及其断面的三维立体结构。

冷冻→割断↑↓取材→清洗→固定→脱水→干燥→粘胶→镀膜→SEM观察↓组织导电脱水管道铸型镀膜SEM生物样品制备基本方法组织悬液