遗传工程课件

2024/5/12遗传工程一、遗传工程概述遗传工程(geneticengineering)是七十年代才开始发展起来的一门新技术。它是在分子遗传学的理论基础上，综合采用分子生物学与微生物学的现代方法和手段建立起来的。这一先进技术的兴起，标志着现代遗传学已发展到定向控制遗传性状的新阶段。一、遗传工程概述遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：解释、研究生物进化的原因、过程和规律(遗传与进化)。改善动、植物和微生物的遗传特性——按照人类的意愿，创造、培育各种生物的新类型、新品种的人工进化过程(育种学)。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决于遗传学所取得的成就。讫今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。六、七十年代的绿色革命；育种工作面临的问题。一、遗传工程概述(一)、遗传工程的基础人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力正在不断提高。遗传工程的理论与技术基础主要来自于：1.分子遗传学的理论；2.生物化学及分子生物学的成就；3.细胞生物学理论和技术。(二)、遗传工程的含义生物技术生物工程：遗传工程；蛋白质工程、酶工程；微生物工程；……遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础上，通过工程设计与施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性。作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1.染色体工程；2.细胞工程；3.基因工程。狭义的遗传工程指的是基因工程。(二)、遗传工程的含义遗传工程或以分为狭义和广义的两种。

广义的遗传工程包括：基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程。习惯上所讲的遗传工程多指基因工程。

基因工程是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。

(二)、遗传工程的含义(二)、遗传工程的含义一般说来，进行基因工程首先需要一个施工的设计蓝图，然后才能进行施工的操作。

基因工程的施工程序大致分为四个步骤：

1、为施工准备材料，即“目的”基因、载体和工具酶等。

2、把目的基因与载体结合成重组DNA分子。

3、把重组DNA分子引入受体细胞，建立分子无性繁系(Clone)或称克隆。

4、从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系，并使外源基因在受体细胞中正确表达。(三)、基因的分离与合成目的”基因即在遗传工程中所需要的基因，它的来源不外乎分离自然的基因与人工合成基因。目前采用的方法主要有两种：鸟枪射击法和化学合成基因。

(一)、利用鸟枪射击法(Shotgun)分离基因；

用限制性核酸内切酶把一个DNA分子切成一个或略大于一个基因的片段，然后把全部片段一一与载体组成重组DNA分子，转化到大肠杆菌K12中去，进行纯系繁殖，使每个基因片段都繁殖到适于研究的数量，再进行分离鉴定，选择出所需要的基因。(三)、基因的分离与合成(三)、基因的分离与合成(二)、基因的化学合成

1970年考兰纳(Khorana，H.G)等采用有机化学的方法首次合成了转录成酵母丙氨酸tRNA的基因，为基因的合成开辟了一条新的道路。考兰纳先合成大量彼此互补的10-15个核苷酸单链片段，然后用连接酶将它们连接并配合成双链。一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述一、遗传工程概述*二、染色体工程染色体工程是物种间遗传转移的最传统的方式，也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。其重要性因作物不同而异：对蕃茄而言，世界上任何具有商业价值的栽培品种都带有一个从野生种导入的抗枯萎病性状，其它六个野生种则是耐盐性、抗虫性等性状的来源。小麦许多抗白粉病基因和抗锈病基因都来源于其野生近缘物种。相反，蚕虫改良则完全是在栽培种(Viciafaba)内进行杂交选择。现在还不能从其它任何种导入基因到该作物中。(一)、种间有性杂交生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易直接影响外源基因导入栽培作物。对不同的作物而言，种间杂交障碍的机制可能截然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：受精前柱头和花柱中的障碍；受精过程中的障碍；受精后胚与种子发育过程中的障碍。受精前障碍与克服障碍机制：物种间花粉管与雌蕊不亲和，在花粉管到达胚珠之前，停止伸长而不能受精。主要克服办法：主要是选择适当的授粉时期，采用正反杂交、蒙导授粉、植物生长调节剂等。另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种内均存在可杂交性遗传变异，并受简单遗传控制。利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。受精过程的障碍与克服被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往往是由于双受精之一失败引起的。讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有成效的研究领域。(四)、染色体工程中的现代技术在传统远缘杂交的基础上采用的现代技术主要是：离体胚(子房)培养技术；植物染色体显带技术；染色体分子原位杂交技术等。染色体工程仍然是外源基因转移最有效、最接近实际应用的技术。*三、细胞工程细胞工程的主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。(一)、细胞、原生质体植株再生采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。对植物而言，细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。曾经是人们公认难题的禾本科植物原生质体再生在近二十多年来也已取得巨大进展。对动物而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。(二)、植物原生质体作为基因工程的受体最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。在这些组织、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化子。因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。(三)、细胞、原生质体融合采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生获得杂种个体(双二倍体)，可避免有性杂交障碍。动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功。当然动物细胞融合都局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。可以预见：用杂种细胞核代替维尔·穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究上发挥重要的作用。植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。四、基因工程基因工程是遗传工程，以至生物工程的核心内容和最前沿技术，最集中地体现了现代生物学理论和技术成就。限制性内切酶和载体是基因工程的众多理论与技术基础中最重要的基石。基因工程的基本步骤可以概括为：目的基因的获得(基因克隆)；目的基因与载体连接(DNA分子重组)；重组DNA分子导入受体；转化子的筛选、鉴定。限制性内切酶P166与DNA连接酶细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用特点是：特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)；I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列；II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子。通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。重组DNA技术是基因工程最核心的技术，贯穿于整个基因工程各个步骤中。限制性内切酶与DNA连接酶细菌细胞具有防御异源遗传信息进入的手段。异源DNA分子进入细菌细胞后，在许多情况下遭到毁灭，这个过程称为限制(restrietion)。限制的能力来源于微生物的一种特殊的酶，称为限制性核酸内切酶。这是一种水解DNA的磷酸二脂酶，它是遗传工程上的一种极其重要的工具酶。

限制性内切酶可分为两大群：

第一群以EcoB，Ecok等为代表，分子量在约为300000。它作用时需要ATP、Mg++、S-腺苷甲硫氨酸等辅助因子，能切断双链，切割部位没有特异性。

第二群以大肠杆菌的EcoR1与嗜血杆菌的HindⅢ为代表，分子量比第一群小，约为20000～100000，与底物作用时，只需要Mg++存在。能切断双链，切割部位在DNA分子上有特定的碱基顺序，即切割部位具有特异性。因此，遗传工程多采用这一群。限制性内切酶与DNA连接酶第二群限制酶有两大特点：(一)、只在一定核苷酸顺序上起作用，在遗传工程上应用最多的是EcoR1，它所切断的部位如动画所示；另一个应用较多的是HindⅢ它所切断的部位如动画所示(二)、多数可以产生粘性末端，即在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状DNA，如动画所示，因此称为粘性末端限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶载体(vector)用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。常用基因工程载体有：细菌质粒(克隆)；λ噬菌体(克隆)；柯斯质粒(克隆)；穿梭质粒(克隆/表达)；细菌人工染色体(克隆/表达)；酵母人工染色体(克隆/表达)；Ti质粒及其衍生载体(转化)。载体(vector)作为载体，至少需要具备下列三个条件：

1、在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地保存。

2、有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因(genemarker)，并能嵌入外源DNA的片段。

3、具有可作为重组DNA分子选择标记的遗传标记。

目前只有少数的细菌质粒，λ噬菌体，类人猿病毒SV40符合上述的条件。载体(vector)载体(vector)质粒(如图11-54)是在细菌中发现的，它是易于取出和引入的小型环状DNA。一般有1～200Kb左右(Kb为千碱基对)它的DNA分子很小，一般为细菌染色体DNA的0.5～3%。一个细菌细胞内质粒的数目可能有1～2个，有的可能有20～60个。基因工程中最有意义的质粒有两类：一类是对多种药物以及重金属和紫外线有抗性的质粒；一类是携带有合成大肠杆菌素基因的质粒。大肠杆菌素是具有蛋白质性质的抗生素，它使大肠杆菌敏感株致死。

λ噬菌体不易引起生物危害，而且用它作为载体DNA有助于进入细胞以及具有在细胞内易于繁殖的优点。λ噬菌体失去其DNA总量的25%，仍不失活，再多则失活。这一部分DNA的空挡正好用于转运其他DNA。(如图11-55)除λ噬菌体外，用其他一些病毒也可以作为载体，特别是将外源DNA移入真核细胞并使之繁殖时，就必须找到一种能在真核细胞内增殖的基因载体，能使灵长类和啮齿类致癌的病毒SV40(如图11-56)就符合这种要求。载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)载体(vector)(一)、目的基因的获得基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。1.基因库构建与目的基因分离；2.PCR扩增、克隆基因；3.化学法合成基因。获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、表达机制以及表达机制研究。克隆(clone)的含义名词(pl.clones)：克隆、无性(繁殖)系。生物个体、细胞的无性繁殖系；同一基因或DNA片段的多份拷贝。动词(cloning)：克隆。细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞；分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有①将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利宿主细胞DNA复制系统进行复制；②利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR,聚合酶链式反应)。基因库构建与目的基因分离基因库(基因文库)：包含特定基因组所有基因、DNA区段的全部分子克隆的集合体。根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库和线粒体库等。构建基因库的基本过程以及从基因库中筛选含目的基因克隆(亚克隆)的方法教材上有简要的描述，本课程仅作为初步了解。分子克隆实验指南(分子生物学与基因工程研究作者的圣经)中译本有一千多页。(二)、转基因受体转基因受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、受体的再生等都有很大的影响。植物基因工程常用受体包括：组织、器官、悬浮培养细胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官发生、胚状体或直接发育而获得转基因植株。动物基因工程受体主要有两类。一类是受精卵或早期胚胎。可以发育形成动物个体(转基因动物)。许多研究发现转基因动物获得的性状可以稳定的遗传，表明外源基因可以整合到受体的染色体上。另一类受体是体细胞无性系。在“多利”诞生之前，这类受体仅局限于获得转基因细胞系供基因表达等的研究，也可用于药物生产。(三)、目的基因导入受体将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是基因工程目标实现的关键环节。在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化(transforming)，将接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称为转化体/转化子(transformant或transgenic~)。最常用转化方法是：载体导入；理化方法导入(微注射、基因枪、电穿孔法、化学法)；还有一种特殊的方法是将外源总DNA导入植物。1.载体法导入外源基因载体法——将目的基因连接到特定的载体(转化载体)上，利用载体进入细胞并整合到受体染色体上的能力实现外源基因转化。Ti质粒及其衍生载体是最常用的植物基因工程转化载体，具有导入外源基因并整合到染色体上的能力。将目的基因与载体连接的过程就是重组DNA分子构建的过程(如前述)。将含有转化载体(重组DNA分子)的根癌农杆菌