第三章 灭菌制剂与无菌制剂课件

药剂学

Pharmaceutics第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

第三章灭菌制剂与无菌制剂第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)灭菌制剂与无菌制剂是指直接注射于体内或直接用于创面、黏膜等的一类制剂。灭菌法是将所有微生物的繁殖体和芽胞杀灭或除去的方法或技术。无菌操作法是将制备过程控制在无菌环境下进行操作的一种技术或控制技术。所谓的菌就是微生物，包括细菌、真菌、病毒等。微生物的种类不同、灭菌方法不同，灭菌效果也不同。第一节概述第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)消毒（disinfection）是指采用物理和化学方法将病原微生物杀死的技术。防腐(antisepsis)系指用物理或化学方法抑制微生物的生长与繁殖的手段。药剂学中采取灭菌措施的基本目的是既要除去或杀灭微生物，又要保证药物的稳定性、治疗作用及用药安全。因此选择灭菌方法时必须结合药物的性质加以全面考虑。故灭菌法的研究对保证产品质量有着重要意义。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)一、灭菌制剂与无菌制剂灭菌制剂：系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。无菌制剂：系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。无菌制剂包括：注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；创面用制剂；手术用制剂等。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)二、灭菌与无菌技术目的：杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽孢，最大限度地提高药物制剂的安全性，保护制剂的稳定性，保证制剂的临床疗效。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)灭菌法的分类方法如下：在制药工业中常用且可靠的的灭菌方法为热灭菌法。本节重点介绍物理灭菌法，其它灭菌法简略说明。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

二、物理灭菌技术

1、热灭菌法（thermalsterilization）加热可以破坏蛋白质与核酸中的氢键，导致蛋白质变性或凝固，核酸破坏，酶失去活性，致使微生物死亡。热灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌，灭菌所需热量与灭菌量、灭菌时间、湿含量等有关。（1）干热灭菌法（dryheatsterilization）有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)1)火焰灭菌法直接在火焰中烧灼灭菌的方法。灭菌迅速、可靠、简便，适用于耐火焰材质的物品，如金属、玻璃及瓷器等用具的灭菌，不适用于药品的灭菌。2)干热空气灭菌法在高温干热空气中灭菌的方法。由于干燥状态下微生物的耐热性强，必须长时间受高热的作用才能达到灭菌的目的。一般认为繁殖性细菌在100℃以上干热1h即可被杀死，而耐热性细菌芽胞在140℃以上时才能使杀菌效率急剧增长。在180℃，灭菌2h或在260℃，灭菌45min对于细菌芽胞的杀菌能力如同繁殖体。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)有关灭菌条件，有的药典规定为135～145℃灭菌需3～5h；160～170℃灭菌需2～4h；180～200℃灭菌需0.5～1h。这只是一般标准，必须通过实验，在保证灭菌物品无损害的前提下指定完全灭菌的温度与时间。此法适用于耐高温的玻璃制品、金属制品以及不允许湿气穿透的油脂类和耐高温的粉末化学药品等。粉针的无菌瓶的干燥常采用干热灭菌法。热源经250℃，30min，或200℃以上45min，可遭破坏。本法的缺点是穿透力弱，温度不易均匀，而且灭菌温度较高，灭菌时间较长，不适于橡胶、塑料及大部分药品。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（2）．湿热灭菌法湿热灭菌法是在饱和蒸气或沸水或流通蒸气中进行灭菌的方法。由于蒸气潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以灭菌效率比干热灭菌法高。

1）热压灭菌法用压力大于常压的饱和水蒸气加热杀灭微生物的方法。此法具有很强的灭菌效果，灭菌可靠，能杀灭所有细菌繁殖体和芽胞，是在制剂生产中应用最广泛的一种灭菌方法。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)热压灭菌所需的温度（蒸气表压）与时间的关系如下：116℃(67kPa)，40min；121℃(97kPa)，30min；126℃(139kPa)，15min。凡能耐高压蒸气的药物制剂、玻璃容器、金属容器、瓷器、橡胶塞、膜过滤器等均能采用此法。影响湿热灭菌的主要影响因素有：a微生物的种类与数量；b蒸汽性质；c药品性质和灭菌时间；d其他第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)卧式热压灭菌柜，是一种大型灭菌器，如图所示，全部用坚固的合金制成，带有夹套的灭菌柜内备有带轨道的格车，分为若干格。灭菌柜顶部装有压力表，指示灭菌柜室内的压力。灭菌柜的上方还应安装蒸气排除阀，以便开始通入加热蒸气时排除不凝性气体。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)操作方法是：在使用前将柜内用刷子洗净。先开夹套中蒸气加热10分钟，夹套压力上升至所需压力时，将待灭菌的物品置于铁丝篮中，排列于格车架上，推入柜室，关闭柜门，并将门匝旋紧。待夹套加热完成后，将加热蒸气通入柜内，当温度上升至规定温度（如115.5℃）时，将此时刻定为灭菌开始时间，柜内压力表应固定在规定压力（如，表压70kPa左右）。在灭菌时间到达后，先将蒸气关闭，排气，当蒸气压力降至“0”时，柜门即可开启，待冷却后将灭菌物品取出。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)注意事项：①必须使用饱和蒸气；②必须将灭菌器内的空气排除。如果灭菌器内有空气存在，则压力表上的压力是蒸气与空气二者的总压并非纯蒸气压，温度达不到规定值。而且实验证明，加热蒸气中含有1%空气时，传热系数降低60%。这些直接影响灭菌效果，因此灭菌器上往往附有真空装置，通入蒸气前将器内的空气抽出；第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)③灭菌时间必须由全部药液温度真正达到所要求的温度时算起。通常测定温度是灭菌器内的温度，不是灭菌物内部温度，因此最好能设计直接测定被灭菌物内温度的装置或使用温度指示剂；④灭菌完毕后停止加热，必须使压力逐渐降到0，才能放出锅内蒸气，使锅内压力和大气压相等后，稍稍打开灭菌锅，待10min～15min，再全部打开。以避免锅内外压差太大、温差太大而使物品冲出和使玻璃瓶炸裂，保证操作人员的安全。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)国内对水针车间的GMP规范化的全面要求，使灭菌器械得到充分的开发与应用。绝大多数GMP认证车间已经采用全自动灭菌器，根据灭菌温度和时间的设定条件将操作温度与时间自动记录与控制，自动计算出F0值，以判断灭菌的完全与否。下图为平移门安瓿水浴灭菌器的流程图。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)安瓿水浴灭菌器是目前国际上对安瓿针剂、口服液等瓶装液体制剂进行灭菌处理和真空检漏的先进设备。它采用高温水淋浴方式对液瓶加热和灭菌,具有温度均匀，温度控制范围宽，调控可靠等优点。同时计算机控制可实现F0值自动计算，对灭菌进行监控。灭菌操作结束后，对灭菌室抽真空，充入颜色，对安瓿进行检漏和清洗处理。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2）流通蒸气灭菌在常压下使用100℃流通蒸气加热杀灭微生物的方法。通常灭菌时间为30min～60min。本法不能保证杀灭所有的芽胞，系非可靠的灭菌法，可适用于消毒及不耐高热的制剂的灭菌。3）煮沸灭菌法把待灭菌物品放入沸水中加热灭菌的方法。通常煮沸30min～60min。本法灭菌效果差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。必要时加入适当的抑菌剂，如甲酚、氯甲酚、苯酚、三氯叔丁醇等，可杀死芽胞菌。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)4）低温间歇灭菌法将待灭菌的物品，用60℃～80℃水或流通蒸气加热1h，将其中的细胞繁殖体杀死，然后在室温中放置24h，让其中的芽胞发育成为繁殖体，再次加热灭菌、放置，反复进行3～5次，直至消灭芽胞为止。本法适用于不耐高温的制剂的灭菌。缺点是：费时，工效低，且芽胞的灭菌效果往往不理想，必要时加适量的抑菌剂，以提高灭菌效率。美国及英国药典没有收载本法。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2、射线灭菌法1）辐射灭菌法以放射性同位素（或）放射的γ射线杀菌的方法。射线可使有机化合物的分子直接发生电离，产生破坏正常代谢的自由基，导致微生物体内的大分子化合物分解。辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度，穿透性强，适合于不耐热药物的灭菌，现已成功地应用于维生素类、抗生素、激素、肝素、羊肠线、重要制剂、医疗器械、高分子材料等物质的灭菌。包装材料也可灭菌，从而大大减少了污染的机会。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2）紫外线灭菌法紫外线灭菌法是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200nm～300nm，灭菌力最强的波长是254nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)3）微波灭菌法用微波照射而产生的热杀灭微生物的方法。所谓微波是指频率在300兆赫到300千兆赫之间的高频电磁波。极性分子在微波电磁场的作用下，按电磁场方向整齐排列，而微波电磁场方向在每秒钟内改变24.5亿次，这些极性分子的排列位置将随电场的改变而急剧改变，分子在快速改变方向的过程中互相撞击、摩擦而产生热，变成宏观的微波加热。水是极性分子，在交变电场的作用下极化并能产生剧烈的转动而发热，因而具有强烈的微波吸收能力。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)微波能穿透到介质的深部，通常可使介质表里一致地加热。本法适用于水性注射液的灭菌。据报道，比较微波灭菌与高压蒸气灭菌对17种化学药物稳定性的影响，证明对高压蒸气灭菌稳定的药物，使用微波灭菌无变化；而对高压蒸气灭菌不稳定的药物，如维生素C、阿司匹林等用微波灭菌，则比较稳定，其分解程度降低。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)国内开发的微波灭菌机是利用微波的热效应和非热效应（生物效应）相结合，实现了灭菌的目的。其中热效应使细菌体内蛋白质变性，细菌失去活性。非热效应干扰了细菌正常的新陈代谢，破坏细菌生长条件。微波的生物效应起到物理化学灭菌所没有的特殊作用，能在低温（70℃～80℃左右）达灭菌效果。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)微波灭菌以低温、常压、省时（灭菌速度快，一般为2min～3min），高效、均匀、保质期长（不破坏药物原有成分，灭菌后的药品存放期可增加1/3以上）、节约能源、不污染环境、操作简单、易维护等优点。我国生产的MMM-6型微波灭菌机，经检验，开机60s，能完全杀灭安瓿内大肠杆菌；开机90s，对安瓿内枯草杆菌黑色变色芽胞灭菌率达99.99%。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)3.过滤灭菌法用过滤方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌的方法。这种机械叫除菌过滤器。主要适用于对热不稳定的药物溶液、气体、水等的除菌。供灭菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液顺畅地由滤器通过，滤液中不落入任何不需要的物质，滤器容易清洗，操作简便。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)繁殖型细菌一般＞1μm，芽胞大小≤0.5μm。对于以表面过筛作用截留的除菌滤器，其孔径必须小到足以阻止细菌和芽胞进入滤孔之内，例如纤维素酯膜滤器的筛孔大小约为0.2μm；对于阻留于孔道内或静电作用截留的除菌滤器，其孔径可稍大于所需滤除的菌体，但压力过大或波动，菌体有被挤过的可能。最常用测定孔径的方法，是用大小为0.7μm左右的灵菌（B.prodigilsus）混悬液过滤，滤液通过培养实验，观察有无灵菌生长。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)灭菌过滤一般选用孔径0.22μm或0.3μm。常用的除菌滤器有G6号垂熔玻璃漏斗、微孔薄膜滤器、孔径在1.3μm以下的白陶土滤柱等。该法应配合无菌操作技术，并对成品必须进行无菌检查，以保证其除菌质量。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)1、灭菌参数（F与F0值）近年来对灭菌过程和无菌检查中存在的问题已引起人们的关注。在检品中存在微量的微生物时，往往难以用现行的无菌检验法检出。因此，有必要对灭菌方法的可靠性进行验证。F与F0值可作为验证灭菌可靠性的参数。

（四）灭菌参数和灭菌验证第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)D值与Z值（1）D值研究表明，微生物受高温、辐射、化学药品等作用时就要被杀灭，其杀灭速度符合一级过程，即：

式中，N0—原有微生物数；Nt—灭菌时间为t时残存的微生物数；k—杀灭速度常数。或第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

lgNt对t作图得一直线，斜率，令斜率的负倒数为D值，即：

由式可知，当lgN0-lgNt=1时D=t，即D的物理意义为，在一定温度下杀灭微生物90%或残存率为10%时所需的灭菌时间（分）。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（2）Z值灭菌条件不同，其灭菌速率也不同。当温度升高时，速度常数k增大，因而D值（灭菌时间）随温度的升高而减少。在一定温度范围内（100～138℃）lgD与温度T之间呈直线关系。令

故Z值为降低一个lgD值所需升高的温度数。即，灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

如Z=10℃，意思是灭菌时间减少到原来灭菌时间的10%，而具有相同的灭菌效果，所需升高的灭菌温度为10℃。上式可以改写为：

设Z=10℃，T1=110℃，T2=121℃，则D2=0.079D1。即110℃灭菌1min与121℃灭菌0.079min，其灭菌效果相当。若Z=10℃，灭菌温度每增加一度，则D1=1.259D2，即温度每增加一度，其灭菌速率提高25.9%。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)F值与F0值（3）F值F值的数学表达式如下：

式中，△t—测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.5～1.0分钟；T—每个时间间隔△t所测得被灭菌物温度；T0—参比温度。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)根据表达式，F值为在一系列温度T下给定Z值所产生的灭菌效力与在参比温度T0下给定Z值所产生的灭菌效力相同时，T0温度下所相当的灭菌时间，以分为单位。即整个灭菌过程的效果相当于T0温度下F时间的灭菌效果。F值常用于干热灭菌。干热灭菌时Z=20℃，参比温度为170℃。评价干热灭菌的相对能力时，必须要保证F值大于60min（170℃），30min（180℃）。破坏大肠杆菌内毒素的F值为250℃时750min。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（4）F0值在湿热灭菌时，参比温度定为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃时，Z值为10℃。则：

显然，F0值为一定灭菌温度（T），Z为10℃所产生的灭菌效果与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效力相同时所相当的时间（min）。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于温度在121℃下灭菌F0分钟的效果，即它把所有温度下灭菌效果都转化成121℃下灭菌的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。按上式定义的F0又叫物理F0，目前F0应用仅限于热压灭菌。灭菌过程中，只需记录被灭菌物的温度与时间，就可算出F0。假设如下数据，△t取一分钟，即每分钟测量一次温度。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)表灭菌过程中不同时间的温度

按表15-3中数据用式15-11计算如下：第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)计算结果说明44min内一系列温度下的灭菌效果相当与在121℃灭菌8.49分钟的灭菌效果。F0值的计算要求测定灭菌物品内部的实际温度，并将不同温度与时间对灭菌的效果统一在121℃湿热灭菌的灭菌效力，它包括了灭菌过程中升温、恒温、冷却三部分热能对微生物的总致死效果。故F0值可作为灭菌过程的比较参数，对于灭菌过程的设计及验证灭菌效果具有重要意义。说明一点，F0值仅是用时间单位表示量值，并不是“时间”的量值。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)将上式编入计算机程序中，将计算机与灭菌器连接，根据测得数据，就可自动显示F0值。F0值随温度变化而呈指数变化，因此温度即使有很小的差别（如0.1～1.0℃），将对F0值产生显著影响。为了使F0测定准确，应选择灵敏度高、重现性好、精密度为0.1℃的热电偶，灭菌时应将热电偶的探针置于被测物的内部，经灭菌器通向温度记录仪。对灭菌工艺及灭菌器进行验证，要求灭菌器内热分布均匀一致，重现性好。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)F0值的影响因素主要有：①容器大小、形状、热穿透系数；②灭菌产品溶液粘度、容器充填量；③容器在灭菌器内的数量与排布等。F0值是121℃时微生物降解所需时间，F0值等于D121值与微生物的对数降低值的乘积。由于F0由微生物的D值和微生物的初始数及残存数所决定，所以F0又叫生物F0。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)式中，Nt为灭菌后预期达到的微生物残存数。又叫染菌度概率（Probabilityofnonsterility）一般取Nt为10-6（原有菌数的百万分之一，或100万个制品中只允许有一个制品染菌）即认为达到可靠的灭菌效果。比如，将含有200个嗜热脂肪芽胞杆菌的5%葡萄糖水溶液以121℃热压灭菌时，其D值为2.4min。则因此，F0值也可认为是相当于121℃热压灭菌时杀死容器中全部微生物所需要的时间。

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为了保证F0值的灭菌效果，应注意以下两个问题。①根据公式，若N0越大，即被灭菌物中微生物数越多，则灭菌时间越长，故尽可能减少各工序中微生物对药品的污染，分装好的药品应尽快灭菌，以使初始微生物数在最低水平。最好使每个容器的含菌量控制在10以下（即lgN0≤1）；②应适当考虑增强安全因素，一般增加50%。如规定F0为8min，则实际操作应控制F0为12min为好。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)四、化学灭菌法化学灭菌法是用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。化学杀菌剂不能杀死芽胞，仅对繁殖体有效。化学杀菌剂的效果依赖于微生物种类及数目，物体表面的光滑度或多孔性以及杀菌剂的性质。化学杀菌的目的在于减少微生物的数目，以控制无菌状况至一定水平。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)1．气体灭菌法

利用环氧乙烷等杀菌性气体进行杀菌的方法。可应用于粉末注射剂、不耐热的医用器具、设施、设备等。常用甲醛蒸气、丙二醇蒸气、三甘醇、过氧醋酸蒸气进行操作室内的灭菌。采用该法灭菌时应注意杀菌气体对物品质量的损害以及灭菌后的残留气体的处理。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)环氧乙烷灭菌器是在一定的温度、压力和湿度条件下，用环氧乙烷灭菌气体对封闭在灭菌室内的物品进行熏蒸灭菌的专用设备。我国已有环氧乙烷灭菌器的系列产品。环氧乙烷气体灭菌的主要特点是穿透力强，杀菌广谱，灭菌彻底，对物品无腐蚀无损害等。灭菌器的结构主要由灭菌室、真空装置、加温及热循环装置、加湿装置、气化装置、气动装置、特殊密封装置、残气处理装置以及相应的控制系统组成。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．药液法

利用药液杀灭微生物的方法。常用的有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液，2%左右的酚或煤酚皂溶液，75%乙醇等。该法常应用于其它灭菌法的辅助措施，即手指、无菌设备和其它器具的消毒等。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)五、无菌操作法无菌操作法是把整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。无菌操作所用的一切用具，材料以及环境，均需按照前述的灭菌法灭菌，操作须在无菌操作室或无菌柜内进行。在药物制剂中，将一些不耐热的药物制成注射剂、眼用溶液、眼用软膏、皮试液等时，往往采用无菌操作法制备。按无菌操作法制备的产品，最后一般不再灭菌，直接使用，故无菌操作法对于保证不耐热产品的质量至关重要。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)1.无菌操作室的灭菌无菌室的灭菌多采用灭菌和除菌相结合的方式实施。对于流动空气采用过滤介质除菌法；对于静止环境的空气采用灭菌方法。常用空气灭菌法有甲醛溶液加热熏蒸法，丙二醇或三甘醇蒸气熏蒸法，过氧醋酸熏蒸法，紫外线空气灭菌法等。近年来利用臭氧进行灭菌，代替紫外线照射与化学试剂熏蒸灭菌，取得了令人满意的效果，是在《GMP验证指南》消毒方法种类中被推荐的方法。该法将臭氧发生器安装在中央空调净化系统送、回风总管道中与被控制的洁净区采用循环形式灭菌。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)臭氧灭菌法①不需增加室内消毒设备；②可以使臭氧迅速扩散到洁净室的每个角落，臭氧浓度分布均匀，因而对空气中的浮游菌及设备、建筑物表面的沉降菌落都能消毒；③对空气净化过滤系统滋生的霉菌和杂菌起到了杀灭作用；④灭菌时间短（一般只需1小时）、操作简便、效果好。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)下图表示甲醛溶液加热熏蒸法的传统气体发生装置。将甲醛溶液放入瓶内，逐渐被吸入蒸气夹层加热锅中，甲醛溶液被加热，甲醛蒸气经蒸气出口送入总进风道，由鼓风机吹入无菌室，连续三小时后，将鼓风机关闭。室温应保持在25℃以上，以免室温过低甲醛蒸气聚合而附着于冷表面，湿度应保持60%以上，密闭熏蒸12～24小时以后，再将25%氨水加热（每m3用8～10ml），从总风道送入氨气约15分钟，以吸收甲醛蒸气，然后开启总出风口排风，并通入经处理过的无菌空气直到室内无甲醛为止。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

除用上述方法定期进行较彻底的灭菌外，还要对室内的空间、用具、地面、墙壁等，用3%酚溶液、2%煤酚皂溶液、0.2%苯扎溴铵或75%乙醇喷洒或擦拭。其它用具尽量用热压灭菌法或干热灭菌法灭菌。每天工作前开启紫外线灯一小时，中午休息也要开0.5～1小时,以保证操作环境的无菌状态。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2.无菌操作操作人员进入操作室之前要洗澡，并换上已灭菌的工作服和清洁的鞋子和帽子，以免造成污染机会。安瓿要150～180℃，2～3小时干热灭菌。橡皮塞要以121℃，1小时热压灭菌。有关器具都要经过灭菌。用无菌操作法制备的注射剂，大多需加入抑菌剂。小量无菌制剂的制备，普遍采用层流洁净工作台进行无菌操作，使用方便，效果可靠，为无菌操作创造了良好的条件。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)在无洁净工作台的情况下，无菌操作也可在无菌操作柜中进行。无菌操作柜构造如下图所示。操作柜的架子用有机玻璃或木制。若用木制，四周配以玻璃，前面操作处装木版，挖两个圆孔，孔内密接橡皮手套或袖套。药品及用具等，由侧门送入。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)操作时可完全与外界空气隔绝。柜内空气的灭菌，可在柜中央安装一小型紫外灯，使用前一小时启灯灭菌，或使用药液喷雾灭菌。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)六、无菌检查法无菌检查法系指检查药品与辅料是否无菌的一种方法。经灭菌或无菌操作法处理后的制剂必须经过无菌检查法检验证实已无微生物生存后，方能使用。《中国药典》规定的无菌检查法有“直接接种法”和“薄膜过滤法”。直接接种法将供试品溶液接种于培养基上，培养数日后观察培养基上是否出现浑浊或沉淀，与阳性和阴性对照品比较或直接用显微镜观察。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)薄膜过滤法取规定量的供试品经薄膜过滤器过滤后，取出滤膜在培养基上培养数日，进行阴性与阳性对照。其具体操作方法以及在一些特殊情况下的变动，可详见《中国药典》附录规定。

薄膜过滤用于无菌检查的突出优点，在于可过滤较大量的样品和可滤除抑菌性物质，过滤后的薄膜，即可直接接种于培养基中，或直接用显微镜观察。故此法灵敏度高，不易产生假阴性结果，操作也比较简便。无菌检查的全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物的污染，因此多在层流洁净工作台中进行。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)三.空气净化技术（一）、概述空气净化(airpurification)技术是以创造洁净的空气为主要目的的空气调节措施。药物制剂行业中的空气净化需要生物洁净，即在除掉空气中的各种尘埃的同时除掉各种微生物等。药品的净化过程是在净化的空气环境中进行的防止药品受到污染、提高药品质量的重要措施之一。分为工业净化和生物净化第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

空气的净化措施与环境的空气状态以及生产对空气的要求密切相关。

①大气中存在的粉尘、烟、雾、蒸气、不良气体、微生物等以及其含有量都会影响空气的净化程度。②生产剂型不同，如片剂、注射剂、输液、软膏、栓剂等以及生产岗位不同，如注射剂中配液、灌封、包装等对空气的净化要求有很大差别。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)《药品生产质量管理规范》（1998年修订）中明确规定“进入洁净室（区）的空气必须净化，并根据要求划分空气洁净级别”。空气净化技术是一项综合性措施。为了获得良好的洁净结果、不仅着重采取合理的空气净化措施，而且必须要求建筑、工艺和其他专业采取相应的措施和严格的维护管理。本节重点介绍空气净化技术。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（二）、洁净室的净化标准与测定方法洁净室的净化标准1．含尘浓度的表示方法空气中含尘浓度常用计数浓度与重量浓度表示。计数浓度：每升或每立方米空气中所含粉尘个数（个/L或个/m3）。重量浓度：每立方米空气中所含粉尘的毫克量（mg/m3）。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．洁净室的洁净度标准目前在国际上没有统一的空气洁净度标准，各国有自己的等级标准。确定室内洁净度标准时，必须考虑尘埃及细菌污染因素。表15-4表示《美国联邦洁净室标准》，各国指定标准时常用来做参考。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)表15-4美国联邦洁净室标准209B

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)我国《药品生产质量管理规范》（1998年修订）中将药品生产洁净室（区）的空气洁净度划分四个级别，见表15-5。表15-5洁净室（区）空气洁净度级别表

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)洁净级别是指每立方英尺中≥0.5μm的粒子数最多不超过的个数，如100级是指每立方英尺中≥0.5μm的粒子数最多不超过100个，10,000级是不超过10,000个。目前按国际单位计算，分别在每立方米中不超过3,500个和350,000个，依次类推。沉降菌落数是指直径为9cm的双碟露置于空气中半小时后落下的菌的个数。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)我国的《药品生产质量管理规范》中对药品生产洁净室（区）的空气洁净度级别的规定基本上与世界卫生组织和一些发达国家的GMP要求相一致，参见下表。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)表15-6一些国家和世界卫生组织对空气洁净度级别的规定1.FS-2009E—

美国联邦标准《洁净室和洁净区内空气浮游粒子洁净等级》；2.WHO—世界卫生组织GMP；3.EC—欧共体GMP；4.NHB5340-2—美国国家航空及宇航局（NASA）《洁净室和洁净工作台微生物控制标准》第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)不同药品、不同工艺程序对洁净度的要求不同，固体口服给药制剂、液体口服给药制剂、粘膜给药制剂、肌肉注射给药制剂、静脉给药制剂等对洁净度的要求依次增高；在输液的制备过程中，灌封岗位的洁净度要求最高。应根据需要选择适宜的洁净级别。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（三）含尘浓度的测定方法目前常用的测量空气中尘粒的大小及计数浓度的方法有光散射法、滤膜显微镜法、比色法。1．光散射式粒子计数测定法当含尘气流以细流束通过强光照射的测量区时，空气中的每个尘粒发生光散射，形成光脉冲信号，并转换成正比于散射光强度的电脉冲信号，散射光的强度正比于尘粒的表面积，脉冲信号的次数与尘粒数目对应，最后由数码管显示粒径与粒子数目。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．滤膜显微镜计数测定法利用微孔滤膜真空过滤含尘空气，把尘粒捕集在滤膜表面，用丙酮蒸气熏蒸，使滤膜形成透明体，然后用显微镜计数。根据采样的空气量及粒子数可计算空气的含尘量。此法可直接观察尘埃的形状、大小、色泽等物理性质，这对分析洁净室污染情况是极为宝贵的资料。缺点是取样、计数麻烦。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)3．光电比色计数测定法用真空泵将含尘空气通过滤纸，然后将污染的滤纸在光源照射下用光电比色计（光电密度计）测出过滤前后滤纸的透光度。在粉尘的成分、大小、和分布等相同的条件下，由于光密度与积尘量成正比，所以可直接测出空气中的含尘量。比色法适用于中、高效过滤器的渗漏检查。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)三、空气过滤洁净室的空气净化方法多采用空气过滤法。当含有粉尘的空气通过具有很多细孔的过滤介质时，粉尘被孔壁吸附或截留而与空气分离。在室内环境中，悬浮粒状物质的粒径绝大多数小于10μm的粒子，而且其粒度分布在粒径4μm附近和1μm以下出现峰值。因此洁净室技术中以0.5μm和5.0μm作为划分洁净度等级的标准粒径。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)空气过滤属于介质过滤，可分为表面过滤与深层过滤。表面过滤系指粒子截留在介质表面上，此时粒子大小必须大于过滤介质的微孔。常用的有醋酸纤维素、硝酸纤维素制成的微孔滤膜。主要用于要求高的无尘、无菌洁净室的末级过滤。深层过滤系指粉尘的过滤过程发生在过滤介质内部，此时尘粒的粒径可小于介质的微孔。常用的介质有玻璃纤维、天然纤维、合成纤维、粒状活性炭、发泡性滤材及薄层滤纸等。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（一）空气过滤机理及影响因素1．

空气过滤机理常用的过滤介质为纤维，其过滤机理复杂，主要有以下几种：①惯性作用：当尘粒随空气流过纤维层的弯曲通道时，由于颗粒的惯性较大，脱离弯曲流线与纤维碰撞而附着。这种作用随气速和粒径的增大而增大；②扩散作用：当尘粒随空气围绕纤维表面作布朗运动时，因扩散作用使与纤维接触而被附着。这一作用在尘粒越小、过滤速度越低时越明显；

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)③拦截作用：当粒径大于纤维间的间隙时，或尘粒与纤维发生接触时，尘粒被纤维截留的作用；④静电作用：当含尘气流通过纤维时，由于摩擦产生的静电作用使尘粒沉积在纤维表面；⑤其它：重力作用、分子间范德华力等作用使粉粒截留在纤维表面。在实际过滤器中多种机理同时作用，只有一种或二种机理是主要的。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．空气过滤的影响因素各种捕集机理的有效性考察表明：①粒径的影响：粒径越大，惯性、拦截、重力沉降作用越大；粒径越小，扩散作用越显著。因此存在过滤效率最低的中间粒径，往往用这一粒径的尘粒检测高效过滤器的效果。对于深层过滤，常用粒径为0.3μm的尘粒来检测。②过滤风速：风速大，惯性作用强，但过强将会使附着的尘粒吹出，而且阻力增大；而风速小，扩散作用强，能捕集小尘粒，而且阻力小。常用极小的风速捕集更小的尘粒。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)③介质纤维直径和密实性：纤维越细、越密实，则接触面积大、惯性作用与拦截作用增强，但过于密实阻力增大，扩散作用弱。④附尘作用：随着过滤的进行，在纤维表面沉积的尘粒可增加拦截效果，但到一定程度后尘粒有再次飞散的可能，因此有必要定期清洗。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（二）空气过滤器与过滤特性1．空气过滤器的分类在空气净化系统中，将过滤器按过滤效率分为粗效（初效）过滤器、中效过滤器、亚高效过滤器、高效过滤器四类。粗效过滤器：主要滤除粒径大于5μm的悬浮粉尘，过滤效率可达20%~80%，除了用于捕集大粒子外，用于防止中、高效过滤器被大粒子堵塞，以延长中、高效过滤器的寿命。通常设在上风侧的新风过滤，因此也叫预过滤器（pre-filter）。粗效过滤器一般采用易于拆卸的平板型或袋型。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)中效过滤器：主要用于滤出大于1μm的尘粒，过滤效率达到20%~70%，一般置于高效过滤器之前，用以保护高效过滤器。中效过滤器的外形结构大体与粗效过滤器相似，主要区别是滤材。亚高效过滤器：主要滤出小于1μm的尘挨，过滤效率在95%~99.9%之间,置于高效过滤器之前以保护高效过滤器，常采用叠式过滤器。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)高效过滤器—简称HEPA（HighEfficiencyParticleAirFilter），主要滤除小于1μm的尘埃，对粒径0.3μm的尘粒的过滤效率在99.97%以上。一般装在通风系统的末端，必须在中效过滤器或在亚高效过滤器的保护下使用。高效过滤器的结构主要是折叠式空气过滤器。高效过滤器的特点是效率高、阻力大、不能再生、安装时正反方向不能倒装第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．空气过滤装置空气过滤器往往把滤材装进金属或木材框架内制成一个单元过滤器，使用时将单个或多个单元过滤器镶在通风管或通风柜里的空气过滤箱体内，如图。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)常用单元过滤器按其结构有如下几种形式，如图所示。（1）板式空气过滤器（a），把滤材装到框架内，两侧用金属网压紧形成平面状，框架采用木材、金属或塑料等制成，是最简单而常用的过滤器。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（2）契式空气过滤器

如图（b），将平板状滤材交错摆放成楔状。常用于中效过滤。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（3）袋式滤过器

如图（c），把滤材作成细长的袋子，然后装入框架上。常用于中效过滤。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（4）折叠式空气过滤器

如图（d），将较薄的垫块状滤材折叠装入框架内，并且采用波纹形分隔板夹在褶状滤材之间，保持滤材褶与褶之间的间隙，支持手风琴状的滤材，防止滤材变形。该过滤器过滤面积大，可减小通过滤材的有效风速，微米级粉尘的捕集效率高，是经济而可靠的高效过滤设备。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)3．空气过滤器的特性过滤特性是评价或选择空气过滤器的重要依据。（1）面速与滤速①面速系指通过过滤器断面上的气流速度，以m3/（m2·s）表示，反映过滤器通过气体的能力，面速越大，过滤器的安装面积越大；②滤速系指通过滤材面积的气流速度（m/s或cm/s），反映滤材的通过气体能力。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（2）过滤效率η在额定风量下，过滤前后空气含尘浓度的变化与过滤前含尘浓度之比称为过滤效率。过滤效率反映滤除去的含尘量，是过滤器的重要参数之一。

式中，C1，C2分别表示过滤前后空气的含尘量。当含尘量以计数浓度表示时，η为计数效率；以重量浓度表示时，η为计重效率。（15-13）第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

不同级别的过滤器串联使用时过滤效率为

式中C1，Cn分别表示第一个过滤器进口的含尘浓度与第n个过滤器出口的含尘浓度；η1，η2，ηn分别表示第一个、第二个及第n个过滤器的过滤效率。

或（15-14）（15-15）第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（3）穿透率K与净化系数KC

穿透率是过滤后和过滤前的含尘浓度比，表明过滤器没有截留的含尘量。

净化系数表明过滤后含尘浓度降低的程度，以穿透率的倒数表示。（15-16）（15-17）第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（4）过滤器的阻力以过滤器进出口处的压差表示。这压差是由气流通过滤材和通过过滤器框架、波纹板等构件时克服的阻力。过滤器的阻力随容尘量的增加而增大，当阻力增大到最初阻力的两倍时，更换或清洗过滤器，此时阻力叫终阻力。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（5）容尘量

指过滤器允许积尘的最大量。超过容尘量时，阻力增大或捕集的尘粒再次飞扬到洁净空气中，降低过滤效率。容尘量一般定为阻力增大到最初阻力的二倍或过滤效率降至初值的85%以下的积尘量。玻璃纤维纸高效过滤器的容尘量约在500g/个。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)四、洁净室（区）的设计制剂生产厂房的内部布置必须根据药品的种类、剂型以及生产工序、生产要求等合理划分区域，即一般生产区、控制区、洁净区、无菌区。一般生产区(generalregion)：没有洁净度要求的车间或生产岗位，如割瓶、成品检漏、灯检、包装岗位等；

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)控制区（controlregion）：洁净度要求为30万级或10万级的工作区；洁净区（cleanregion）：对洁净度的要求为1万级的一般无菌工作区；无菌区（sterileregion）：对洁净度的要求为100级的工作区。常用1万级背景下再设置层流式洁净罩或层流式洁净棚，局部100级，以减少安装费用并有利于确保100级的工作区，一般不采用整个室作成100级的层流洁净室。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

部分生产工序与洁净度级别的要求介绍如下：100级或10,000级背景下的局部100级：无菌药品需灭菌的≥50ml大容量注射剂的罐装，不需除菌过滤的药液的配制、灌封、分装和压塞，冻干粉针的罐装、压塞等；10,000级：注射剂的稀配、过滤，小容量注射剂的罐封，罐装前需除菌过滤的药液的配制，供角膜创伤或手术用滴眼剂的配制和罐装等；

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)100,000级：注射剂的浓配和采用系统的稀配，非最终灭菌口服液体药品的暴露工序，深部组织创伤外用药品、眼用药品的暴露工序，阴道、鼻粘膜用药等暴露工序；300,000级：最终需灭菌的口服液体药品的暴露工序，口服固体药品的暴露工序，表皮外用药品暴露工序，直肠用药的暴露工序，原料的精制、干燥、包装环境等。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（一）洁净室的布置

洁净区一般由洁净室、（空）气闸、风淋、亚污染区、厕所、洗澡间、更衣室等组成。图为1万级洁净室的安排形式之一。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)各个部位的布置必须在符合生产工艺要求的前提下，明确人、物流以及空气流的流向，以保证洁净室的洁净度。人员进入准洁净区的流程为：外更衣室→洗净室→更衣室→风淋室→准洁净室；操作人员进入洁净室的流程为：外更衣室→脱衣室→淋浴室（水洗）→风淋室→更衣室→风淋室→无菌走廊→无菌室。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)洁净室布置的基本原则为①洁净室内设备布置尽量紧凑，以减少洁净室的面积；②洁净室内不安排窗户或窗户与洁净室之间隔以封闭式外走廊；③洁净室的门要求密闭，人、物进出口处装有气闸（airlock）；④同级别洁净室尽可能安排在一起；第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)⑤不同级别的洁净室由低级向高级安排，彼此相连的房间之间应设隔门，按洁净等级设计相应压差，一般10Pa左右，门的开启方向朝着洁净度级别高的房间；

⑥洁净室应保持正压，洁净室之间按洁净度等级的高低依次相连，并有相应的压差以防止低级洁净室的空气逆流到高级洁净室。空气洁净级别不同的相邻房间之间的净压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的净压差应大于10Pa，门的开启方向朝着洁净度级别高的房间；第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)⑦照光度按GMP规定应超过300Lx以上；⑧无菌区紫外光灯，一般安装在无菌工作区之上侧或入口处；⑨除工艺对温、湿度有特殊要求外，洁净室温度宜保持在18～26℃，相对湿度45%～65%。详细内容参见《药品生产质量管理规范》的有关规定。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（二）洁净室对内部结构的要求洁净室对墙壁与地面总的要求是：便于清扫，防湿，防霉，不易开裂，不易燃烧，导电性好，经济等。因此从材料的选择到施工与洁净度紧密相关。1．地板地面对洁净度的影响较大，在洁净室的内部构造中，地板是关键，而且不易做到很完美的程度。因为工作人员在地面上活动而发尘量较大所致，一般发尘量取值为4.5×105粒/（㎝3·min）。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)对地板的要求有①有弹性而光滑的地板材料为好，缺乏弹性的地板材料易产生缺口而容易积尘；②地板和壁面相接的墙角最好做到曲面，以便清扫。常用地面材料有：水磨石地面、铝、塑料、环氧树脂、聚氨酯、聚氧乙烯等。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．墙墙面的发尘量较少。对于大面积墙，常采用高密度块材砌成后表面贴瓷砖或涂上漆类以形成坚实的表面，光滑无隙。常用涂料有聚氨基甲酸乙酯、过氧化乙烯漆、乳胶漆、普通瓷漆等。对小面积的洁净室可用塑料板、铝板等作隔墙。3．顶棚各种管道，如水管、风管、高效过滤器和照明设施（包括紫外灯）都可装嵌在天花板吊顶内。天花板采用镶板、混凝土等。天花板最好能用隔音板包于塑料薄膜内，以减少噪音。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（三）洁净室对人、物的净化要求洁净室的设计和施工即使很完善，维护和管理不当也同样使洁净度达不到要求。有人认为对污染的控制效果设备占50%，管理占50%。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)1．对人的要求在洁净室内人是粉尘和细菌的主要污染源。人的皮肤和头发中剥落下来的皮屑，呼吸和说话时吐出的唾液，衣服中脱落下来的纤维都成为污染的物质，特别是人的一举一动更使污染加剧。为了减少人为产生的发尘量，操作人员进入洁净室之前必须水洗（洗手、洗脸、淋浴等），更衣鞋帽，空气吹淋（风淋）；工作服必须用专用服，尽量盖罩住全身，减少皮肤外露，衣料采用发尘少、难于吸附、不易脱落的紧密的尼龙、涤纶等织物。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)2．对物的要求使用的原料、仪器、设备等在进入洁净室前均需清洁处理。按一次通过方式，边灭菌边送入无菌室内。如安瓿等，在生产流水线上经过洗涤和灭菌后，用传递带通过洁净区隔墙上开的空洞陆续送入无菌室。由于洁净室内保持正压，或空洞上方设有气幕，或设置紫外灭菌等，可防止尘埃进入洁净室。又如灭菌柜安装在贯通无菌室的墙壁，一端开门于生产区，另一端开门于无菌室，把物料从一般生产区装入，经灭菌后从另一端无菌室开门取出。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)（四）洁净室的气流组织由高效过滤器送出来的洁净空气进入洁净室后，其流向的安排直接影响室内洁净度。气流形式有层流式和乱流式。1．层流（laminarflow）是指空气流线呈平行，又称平行流或单向流。由于层流的流线为单一方向且相互平行，各流线间的尘粒不易从一个流线扩散到另一流线上去。该气流方式的基本形式类似气缸内活塞动作，把室内发生的粉尘以整层气流形式推出室外。第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)

即使气流遇到人、物等发尘部位，尘粒也很少扩散到全室，而随平行流迅速流出，从而容易保持洁净度。只要过滤器送风口和工作面之间不存在发尘源，在工作面上始终能够得到100级洁净的空气，工作面下风侧为1000级左右。层流常用于100级的洁净区。层流分为垂直层流与水平层流，如图。

第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)第三章灭菌制剂与无菌制剂(2)垂直层流（verticallaminarflow）以高效过滤器为送