标准菌种确认标准操作规程

标准菌种确认标准操作规程第页一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。三内容1.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.11.1.11.1.11.1.11.1.21.1.2.11.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认1.2菌种确认试验的主要内容1.2.11.2.11.2.1①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。1.2.2菌种的特1.2.21.3菌种的确定方法用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。1.3.11.3.11.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～1.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。1.3.11.3.1①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（①、②）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰2～3次干燥使固定。②滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。③滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。④滴加95﹪乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。⑤滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。1.3.1.2.2染色结果应是：革1.3.1.2.3镜检结果应是：1.3.11.3.1.3.1靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液1.3.1.3.2甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中加入甲基红指示液2～1.3.1.3.3乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，，于2ml培养液中加入α1.3.1.3.4枸橼酸盐利用试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐1.3.1.3.5乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂1.3.2干燥、皱缩、无典型卷发状。1.3.31.3.31.3.31.3.41.3.41.3.4.1.1取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经35℃培养24～48h后，1.3.4.1.2取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72小时）观察结果：1.3.4.1.3取上述（5.3.4.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长至72小时）观察结果1.3.4取上述（5.3.4.1.3）培养物接种至1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养24～48h。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。1.3.41.3.4.2.2芽管试验：挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃1.3.4.2.3镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为1.3.51.3.51.3.61.3.6.1取铜绿假单胞菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃1.3.6.1.1取上述培养物接种于溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养18～1.3.6.21.3.61.3.61.3.6.3氧化酶取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单孢菌。否则，应进行绿侬菌素试验。1.3.6.4绿侬菌素(Pyocyanin)试验取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3~5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿侬菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDF琼脂培养基斜面同法做阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阳性，判断供试品检出铜绿假单胞菌。上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。1.3.71.3.7.1取生孢梭菌新鲜培养物2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接后处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48~