羊李斯特菌病诊断技术

羊李斯特菌病诊断技术本文件规定了羊李斯特菌病的临床诊断、病理学诊断和实验室诊断的技术要求。本文件适用于羊李斯特菌病的诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1李斯特菌病listeriosis由李斯特菌引起人和动物的一种重要的人兽共患传染病，呈散发或暴发发生，主要表现为脑膜炎、败血症和怀孕母羊流产。3.2李斯特菌溶血素OlisteriolysinO,LLO单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的主要毒力因子，对真核细胞膜具有裂解活性。4临床诊断单核细胞增生李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为脑膜脑炎、败血症和流产。发病初期，羊体温升高1℃~2℃,采食、咀嚼、吞咽困难，头颈呈一侧性麻痹，弯向对侧，做转圈运动。角弓反张，昏迷卧于一侧，直至死亡。病程短的2d～3d，长的1至3周或更长时间。妊娠母羊流产，羔羊常发生急性败血症而很快死亡。伊氏李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为胃肠炎、新生羊败血症和怀孕母羊流产，罕见病例呈脑膜脑炎相关的临床表现。5病理诊断5.1眼观病变眼观病变表现如下：a）神经症状的病羊：脑及脑膜充血、水肿，脑脊液增多，稍浑浊；b）败血症型的病羊：肝脏呈多灶性坏死，脾脏肿大，心外膜下出血；c）流产母羊：有胎盘炎，子宫内膜和胎盘充血及广泛坏死。5.2组织病理学变化血液中白细胞总数升高，单核细胞增多，炎性细胞灶及其邻近的血管周围呈套袖现象，占主导的细胞是淋巴细胞、组织细胞、浆细胞；脑干嗜中性粒细胞液化。6实验室诊断6.1细菌学诊断6.1.1细菌分离和培养无菌采取病羊的脑脊髓液、脑、肝、脾、心、肺和肾组织，置于放有冰袋的采样箱中（温度低于10℃)于24h之内运回实验室，直接涂片镜检，取样品直接接种到科玛嘉平板上于37℃培养24h，同时按照附录A的方法进行增菌和鉴定；或按照GB4789.30推荐的方法进行增菌，转接到牛津琼脂平板上，放置在37℃培养，培养至24h和48h检查细菌培养情况。6.1.2菌落形态及革兰氏染色菌落形态：李斯特菌在脑心浸液平板上培养24h后，形成直径约为1mm～2mm的乳白色菌落，边缘整齐、表面光滑、隆起度高，粘稠、易挑起（附录A中图A.1）。在科玛嘉培养基上形成的菌落呈蓝绿色，菌落周围有白色晕环（见附录A中图A.2）。在含七叶苷的琼脂培养基（如MOX平板）上形成的菌落呈黑色（见附录A中A.3）。革兰氏染色镜检：革兰氏染色阳性的小杆菌，两端钝圆，排列成“V”型或并列排成栅栏状。6.1.3生化特性根据菌落特征选取5个菌落，观察细菌形态及在血琼脂上培养后的溶血活性，测定细菌发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖及水解七叶苷的能力。单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的生化特征如表1所示。表1李斯特菌的生化特征应++--++-菌++---+++*血清型4h的单核细胞增生李斯特菌不能利用鼠李糖**血清型4h的单核细胞增生李斯特菌协同溶血反应呈阳性***在划线有马红球菌的血平板上呈铲型溶血（见附录A中图A.4）6.1.4毒力鉴定将强毒菌株以1根106CFU腹腔注射小鼠后，小鼠14天内死亡。小鼠脾脏、肝脏、淋巴结、肺脏、肾上腺、心肌、胃肠道中有较小的坏死灶。取心血、肝、脾直接做涂片，镜检出现大量呈“V”型或栅栏状的革兰氏阳性杆菌。6.2分子生物学诊断挑取细菌的菌落作为PCR的模板，用属特异性引物PCR扩增出370bp的条带判定为李斯特菌属；用单核细胞增生李斯特菌特异性引物PCR扩增出660bp的条带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌特异性引物PCR扩增出1100bp的条带判定为伊氏李斯特菌（附录B）。6.3血清学诊断以李斯特菌溶血素O作为包被抗原、羊血清样品作为第一抗体、酶标兔抗羊IgG作为第二抗体，建立间接ELISA检测的血清学方法，应用于流行病学调查，具体操作和判定方法见附录C。7结果判定综合临床诊断、病理学诊断及实验室诊断结果，报告羊是否发生李斯特菌病。患病动物表现神经症状、败血症或流产、体温升高，血液中单核细胞增多，可疑为李斯特菌病。进一步从病死羊中分离鉴定出单核细胞增生李斯特菌或伊氏李斯特菌，可以确诊；若未分离到李斯特菌，但患病一周后的羊血清间接ELISA测定结果阳性，也判定羊患有李斯特菌病。8安全措施按照GB19489执行。（规范性）李斯特菌的分离与鉴定取10g固体样品或10mL液体样品（包括血液样品）放入90mLLEB增菌液中（纱布、棉签直接放入30℃培养16h。然后用接种环取培养液在科玛嘉显色平板上划线，37℃培养24h。选取带白色晕环的蓝绿色菌落在脑心浸液培养基（BHI）平板上纯化培养，单菌落用于后期的进一步鉴定。图A.1脑心浸液培养基（BHI）上的单核细胞增生李斯特菌菌落图A.2科玛嘉平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落图A.3MOX平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落图A.4血平板上的李斯特菌与马红球菌的协同溶血试验（图A1、A.3和A.4为伊氏李斯特菌；图A.2为单核细胞增生李斯特菌）（规范性）PCR方法鉴定李斯特菌B.1.1李斯特菌属鉴定引物：扩增产物长度为370bpB.1.2单核细胞增生李斯特菌鉴定引物：扩增产物长度为660bpB.1.3伊氏李斯特菌鉴定引物:扩增产物长度为1100bpB.2PCR扩增B.2.1以细菌的基因组为模板，利用引物PseF和PseR首先对分离菌株进行李斯特菌属的鉴定。PCR反应体系（50μL）：超纯水34.6μL，10×Buffer（含Mg2+）5μL，dNTP4μL，rTaq酶0.4μL，上下游引物各2μL，模板2μL；PCR反应条件：94℃5min；94℃50s，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。B.2.2反应结束后，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分离株鉴定为李斯特菌属后，继续用2种引物（MonoA和LisB）和（Ival和LisB）分别进行种鉴定，PCR反应体系如下：超纯水27.75μL10×PCR缓冲液5μLdNTP(2.5mM)5μLMonoA、Iva1各2LisB4μLrTaqDNA聚合酶0.25μLDNA模板4μL总的反应体系50μLB.2.3在对李斯特菌进行PCR的过程中，若以菌落为模板做PCR，则DNA模板体积为0，以超纯水补齐不足部分的反应体系。细菌的加入方法为：用灭菌牙签挑取菌落，转移至加有50μL反应混合液的PCR管中与管壁轻轻摩擦和搅动。PCR反应条件为：94℃5min；94℃50s，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min。B.2.4反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。反应的体系与条件参照李斯特菌属鉴定，其中退火反应设为58℃,1min。用属鉴定引物PCR扩增出370bp的条带判定为李斯特菌属；用单核细胞增生李斯特菌鉴定引物PCR扩增出660bp的带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌鉴定引物PCR扩增出1100bp的条带判定为伊氏李斯特菌。若扩增出370bp左右的条带，则对应菌株鉴定为李斯特菌属的细菌，如图B.1泳道1和2所示。在扩增出李斯特菌属特异性条带的前提下，若扩增出660bp的条带，如图B.2第1泳道所示，则为单核细胞增生李斯特菌；若扩增出1100bp的条带，如图B.2第2泳道所示，则为伊氏李斯特菌。图B.1李斯特菌属鉴定PCR扩增结果图B.2单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌种PCR扩增结果（规范性）间接ELISA方法检测抗LLO的血清抗体C.1用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液将LLO蛋白稀释，包被于96孔板中，包被量为0.5μg/孔，于4℃过夜吸附。C.2次日用PBST洗涤3次~5次，每次5min，拍干。C.3然后用1%BSA封闭，每孔200μL，37℃作用2h，洗板同上。C.4加入待检血清（用PBST1:400稀释每孔100μL，同时设立阴、阳性对照孔，37℃作用2h，洗板同上。C.5