(4.6)-自主实验设计与实践课题申请书

生物化学实验自主实验设计与实践课题申请书摘要课题研究内容和意义简介：目前关于酵母种蔗糖酶的提取的研究报告较多，本文将从各种细胞破碎方法的原理、与优缺点、缓冲液的选择、分级沉淀技术以及蛋白透析技术着手进行蔗糖酶提取与纯化的实验。本次专题报告，能够为我们增加对“蔗糖酶的提取”的进一步了解，在自主实验中更好的了解背景研究以及提供思路。关键词（用分号分开，最多5个）细胞破碎；缓冲液的选择；分级沉淀；蛋白质透析基本信息立题依据与研究内容：1、课题的立题依据。由于我们组在秋学期蔗糖酶系列实验中对于酵母的研磨和蔗糖酶的纯化所得到的结果并不是很理想，因此我们在冬学期的自主探究实验中，决定进一步对“蛋白质的提取纯化”这一主题进行研究，并决定将所了解到的关于蛋白质的提取的知识“知行合一”地融入到实践中去，更好地吸收、理解蛋白质的提取这一方面的学识。2、课题的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。（1）研究内容：目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多1-5，提取方法以超声破碎法、冻融法、高速珠磨法3种不同的方法最为常见，以下将对这三种蔗糖酶的提取方法进行研究。（2）研究目标：学习三种提取方法并比较其优缺点以及蛋白质的提取率，学习蛋白质透析方法与技术，比较其与离子交换层析纯化方法的不同与优劣。（3）拟解决关键问题：三种提取方法的可行性，透析技术的学习。3、拟采取的研究方案及可行性分析（1）提取超声破碎法常⽤频⾼于15～20KHz的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适⽤于微⽣物材料，在⾼强度声能输⼊下可以进⾏细胞破碎。其破碎机理与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。但是酵母细胞壁厚,单纯超声破碎酵母细胞的方法总体效率不高冻融法在冷冻过程中，低温会促使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；反复冷冻能够使细胞内形成冰晶，引起细胞膨胀而破裂。由于整个提取过程保持较低温度，酶失活率较低，因此使用冻融法提取蔗糖酶能够更好的促进细胞破碎，保留蔗糖酶活性。物理剪切法物理剪切法中，高速珠磨法是一种有效的破碎方法，珠磨机是该法所用的设备。进入珠磨机内的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，珠子之间以及珠子与细胞之间的相互剪切、碰撞,使细胞破碎,释放出内含物。（2）纯化在蔗糖酶的提取纯化中，一般选择使用乙醇进行分级沉淀1，3，相较于乙醇单次沉淀具有更好的纯化效果。（3）透析透析可以除去盐、有机溶剂以及分子量小于透析袋规格的杂蛋白，充分保留所需蛋白。但为了获得较好透析效果的同时保持蛋白质的活，性需要长时间在低温环境下进行并且不停更换缓冲液，总体流程所需时间较长。4、课题的特色与创新之处相较于秋学期系列实验，本组的自主实验设计优化了蔗糖酶提取方法和初步纯化方法，采用了一种新的提纯方法——透析法，在保留了酿酒酵母全蛋白的基础上进行蛋白透析以确保蔗糖酶的充分保留，避免因离子交换层析纯化蔗糖酶过程中较复杂步骤导致的操作失误。同时，通过对比全蛋白直接透析与乙醇分级沉淀初步提纯后透析，可以比较得出乙醇提纯的效果，验证该提纯步骤对于蔗糖酶活性的影响。5、研究计划及预期研究结果图1实验流程与设计图冬学期自主实验流程设计图见图1。研究计划：由于实验室设备与材料限制，预想使用的球磨法因没有酸洗玻璃珠无法实行，故采用超声波破碎法。取10g市售酵母菌，加入20mL的20mmol/LTris-HCl缓冲液（pH6.7）溶解，使用超声波细胞破碎仪，Ⅳ档下以60%功率，运行15s/间隔10s条件进行细胞破碎30min，处理后得到米黄色浑浊溶液，4℃、12000r/min离心15min，取1mL上清液留作样品Ⅰ用于酵母蛋白含量测定和蔗糖酶活力测定。将留样后的上清液均分为两份，一份经过50℃水浴30min的热处理后4℃下12000r/min离心15min，取上清液并留样1mL作样品Ⅱ；向热处理后的上清液中加入乙醇使其质量分数达30%，4℃、12000r／min离心15min，取上清液再追加乙醇使其质量分数达50％。4℃、12000r／min离心15min，弃上清液，往沉淀中加入10mL的20mmol/LTris-HCl缓冲液将沉淀溶解，并取1mL留作样品Ⅲ；将上述蛋白粗提液装入透析袋（100kD，MD34，Biosharp）中进行透析，透析后取袋内液体，4℃、12000r/min离心10min，取上清液作样品Ⅳ。另一份直接装入透析袋中透析，袋内液体经4℃、12000r/min离心10min后取上清液作样品Ⅴ。两组透析操作相同，透析液均使用20mmol/LTris-HCl缓冲液，为防止袋内溶液浓度过高，液体流入较多导致透析袋撑破，每1-2日观察情况并更换透析液，持续5-7日。第二周起对第一周实验所得的样品Ⅰ-Ⅴ进行蛋白含量与蔗糖酶活力测定，采用方法与秋学期所用的相同，使用Folin-酚法测定蛋白浓度与含量、DNS法测定蔗糖酶活性，此处不再赘述。第三周起对样品进行SDS电泳，操作与秋学期相同。进行SDS电泳的目的是验证透析操作的效果，结合第二周所得蛋白含量与蔗糖酶活性的数据对透析法的优劣进行分析。相关分析请见下文“预期实验结果”部分。预期研究结果：在进行实验之前，预期实验结果为：分析样品Ⅰ，相较于秋学期用的研磨破碎法，超声波破碎法对细胞的破碎较为完全，蛋白释放率更高；分析样品Ⅳ和Ⅴ，相较于全蛋白直接透析，经过热处理和乙醇分级沉淀处理后透析所得的蛋白中蔗糖酶纯度更高；结果SDS电泳结果表明，样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的总蛋白含量较高，杂蛋白的含量也很高，两者根据处理步骤依次递减，即总蛋白含量与杂蛋白比例均为：Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ；样品Ⅳ与Ⅴ经过透析后，蔗糖酶含量几乎不变，杂蛋白含量显著减少，尤其是分子量100kD以下的杂蛋白几乎完全滤出。透析法对于蔗糖酶的提纯有较好的效果且操作简单，步骤较少。经过第一周的实验后，对于自主实验有了新的分析。具体如下：根据相关研究3，玻璃珠破碎法（高速珠磨法）对于酵母全蛋白的释放与提取最为理想，蛋白浓度可达0.92±0.01g/L，超声波破碎法的效果较差，蛋白浓度为0.78±0.03g/L。是我们组秋学期采用的研磨破碎法（湿法研磨）所得样品Ⅰ的蛋白浓度仅有11.87mg/L，相较之下无论是采用珠磨法还是使用超声波法都可以近百倍的提升蛋白的提取率，保证后续纯化实验的顺利进行。原先设想采用100kD与200kD规格的两种透析袋分别透析并对比，但200kD规格的透析袋较少，未能购得，因此仅使用了100kD规格的透析袋进行试验。由于蔗糖酶外酶的分子量约为270kD，内酶的分子量约为135kD，且外酶的活性较高，因此使用100kD透析袋对于保留蔗糖酶内酶的效果较好，但也会导致杂蛋白含量更高，蔗糖酶所占比例下降，活性降低。结合对于酿酒酵母全蛋白组的研究6-10，参考其对于酵母近全蛋白组的电泳结果（见图2），大部分蛋白质的分子量集中在20-100kD区间，100kD与200kD以上的蛋白质较少，因此我认为使用100kD规格的透析袋进行透析与使用200kD规格透析袋最终所得结果相近，透析后液体所含杂蛋白增多但不会有显著区别，不影响实验进行。图2酵母全蛋白的电泳结果与分析通过查阅相关文献与专利所知，酿酒酵母内有多种蛋白水解酶（protease），已知有胶原蛋白酶11（collagenases）、Caspase蛋白酶家族、Caspase同系物Matacaspase（Mca1）12等多种蛋白酶13-17。由于细胞破碎的过程中蛋白水解酶也会被释放出来，因此需要考虑这些蛋白水解酶在实验过程，尤其是长时间的透析中对于提取所得蛋白的影响。蛋白水解酶的分子量一般在20kD-30kD左右，相关文献中酵母内所含的蛋白水解酶的分子量也均未超过100kD，理论上不会在透析袋内停留太久，因此认为其影响时间较短。由于所学知识有限，仅对上述三类蛋白水解酶进行进一步分析。胶原酶能辨识并剪切Pro-X-Gly-Pro多肽序列，而此序列在胞外基质主成分-胶原蛋白中出现的频率比一般蛋白高很多，使得胶原酶能较专一的作用在胞外基质上。因此可认为胶原酶对于蔗糖酶无降解作用，并且能够清除酵母全蛋白提取液中胶原蛋白类的杂蛋白。Caspase家族与Mca1通常与细胞凋亡程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）的调控紧密相关，且使用酵母作为研究细胞凋亡模式生物的研究也较为成熟18，部分文献19-22也表明Caspase与Mca1通常对细胞的寿命具有积极影响，通过参与细胞的蛋白质质控（proteinqualitycontrol，PQC）等途径维持细胞的稳态。在研磨和提纯过程中，酵母或许会因为生存环境的变化而较多表达Caspase系列蛋白酶，但未见其对于蔗糖酶活性的直接影响。结合酵母全蛋白提取与确认的相关研究，我们认为，在透析过程中上述三类蛋白酶不会对蔗糖酶的活性造成负面影响。若实验能够顺利完成并进行了SDS电泳，后续才能够针对100kD以下蛋白的含量、分布及其出现的原因进行更深入的分析。参考文献[1]李楠,庄苏星,丁益.酵母蔗糖酶的提取方法[J].食品与生物技术学报,2007,26(4):83-87.[2]梁敏,李楠楠,邹东恢.蔗糖酶的提取工艺及性质研究[J].湖北农业科学,2010,49(9):2218-2220.[3]方芳,赵华,咸漠,刘辉.酿酒酵母全蛋白的提取[J].食品与发酵工业,2014,40(09):180-184.DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.2014.09.057.[4]吴娜.酵母蔗糖酶的分离纯化[J].中国化工贸易,2015(14):271-271.[5]许培雅,邱乐泉.离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究[J].实验室研究与探索,2002,21(3):82-84.[6]PicottiP,Clément-ZizaM,LamH,CampbellDS,SchmidtA,DeutschEW,RöstH,SunZ,RinnerO,ReiterL,ShenQ,MichaelsonJJ,FreiA,AlbertiS,KusebauchU,WollscheidB,MoritzRL,BeyerA,AebersoldR.Acompletemass-spectrometricmapoftheyeastproteomeappliedtoquantitativetraitanalysis.Nature.2013Feb14;494(7436):266-70.doi:10.1038/nature11835.[7]GaoY,PingL,DuongD,ZhangC,DammerEB,LiY,ChenP,ChangL,GaoH,WuJ,XuP.Mass-Spectrometry-BasedNear-CompleteDraftoftheSaccharomycescerevisiaeProteome.JProteomeRes.2021Feb5;20(2):1328-1340.doi:10.1021/acs.jproteome.0c00721.[8]ZhuH,BilginM,SnyderM.Proteomics.AnnuRevBiochem.2003;72:783-812.doi:10.1146/annurev.biochem.72.121801.161511.[9]Krogan,N.,Cagney,G.,Yu,H.etal.GloballandscapeofproteincomplexesintheyeastSaccharomycescerevisiae.Nature440,637–643(2006)./10.1038/nature04670[10]RuiChen,MichaelSnyder,Yeastproteomicsandproteinmicroarrays,JournalofProteomics,Volume73,Issue11,2010,Pages2147-2157,ISSN1874-3919,/10.1016/j.jprot.2010.08.003.[11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