药物分析情况

约PharmaceuticalAnalysis1E/o/c/o2023/9,第体

内

药2中国医药科技出版衬五物

分

析体内药物分析TINEIYAOWUFENXI主编李好枝全国高等医药院校药学类规划教材GAOOENG

YVaO

VADNOVAOXL*L

aut

Ja

Maoc*E/o/c/o普通高等教育“十一五”国家级规划教材2023/9

常用体内样品的制备与贮藏2°体内样品分析的前处理3°

体内样品分析方法与方法验证第

五

章体内药物分析2023/9/1第

五

章握

，体内药物分析的特点和应用

体内样品分析的前处理体内样品分析方法验证的内容熟

悉

：体内样品的采集与制备方法体内样品分析方法验证的技术要求了

解

：体内药物分析的性质与意义2023/9/1

4体内药物分析的特点和应用握

体内样品分析的前处理体内样品分析方法验证内容

要

求熟

悉

体内样品的体内药物分析

的性质与意义2023/9/1采集与制备方法

体内样品分析方法

验证的技术要求掌学

习了

解体

内

药

物

分

析概

述体内药物分析分析方法样品制备存在形式体内样品2023/9/1·

色谱；免疫分析；生物

·全面验证和部分验证·

去蛋白；萃取；膜分离

·水解；化学衍生化·原形药物或其代谢物

·缀合物，蛋白结合物

·血液是主要样品·

尿液，唾液，头发和脏器6方法建立与验证净化与浓集原形，代谢物体液或组织1.体内样品的特点(1)采样量少：

ml~μl级；且不易重新获得~

(2)待测物浓度低：μg/ml2023/9/12.体内药物分析的特点(1)样品需经纯化浓集，

或化学衍生化处理(2)对分析方法的灵敏度及专属性要求较高

(3)分析工作量大，数据

处理和结果阐明繁杂体内药物分析的特点主要来自于体内样品的特点ng/ml级，甚至pg/ml(3)干扰物质多：尤其是

血样和组织中的蛋白质概

述特

点第

一

书

常用体内样品的制备与贮藏①

体内样品的种类2

)

体

内

样

品

的

采

集

与

制

备3体内样品的贮藏与处理2023/9/1血液；唾液脑脊液；胃液；

胆汁；乳汁；精

液；泪液2023/9/1一

、

体

内

样

品

的

种

类排泄物尿液粪便；汗液胃；肠；肝；肾；肺，脑；肌肉；头发组织体液9二、体内样品的采集与制备1.血样的采集静脉，1-5ml

≤1/1050-60%2.血浆的制备抗

凝

剂

，1000×g

离心

5-10min淡黄色上清液20-40%3.血清的制备30min-1h1000×g

离心

5-10min上层淡黄色液体4.全血的制备抗凝剂，不离心>

血

样TDM

测定S

代替P

进行临床监测1.唾液的组成腮腺，舌下腺和

颌下腺2.唾液的采集漱口15min,

安

静状态，自然

流出的唾液

物理或化学方

法刺激3.

样品的制备3000r/min离心

10min,上清液>

唾

液1.尿样的特点原形，代谢物及缀合物药物浓度较高收集量大(1~5L)2.尿样的采集自然排尿规定时间段(6-8h)(时间尿)3.尿样的贮藏加入适当防腐剂>

尿

样1.样品的制备制成水性基质

匀浆溶液2.样品的处理(1)沉淀蛋白法

(2)酸/碱水解法

(3)酶水解法蛋白水解酶中的枯草菌溶素>

组

织常见体内样品2023/9/110三、体内样品的贮存与处理(一)冷藏与冷冻短期保存：冰箱(4℃)冷藏长期保存：冷柜(-20℃/-70~-80℃)冷冻，小体积分装

1.血浆/血清：分离(x2h),硬质玻璃/聚乙烯管(EP),

冷冻

2.尿样：冷藏(24~36h)加防腐剂3.唾液：冷冻保存时，解冻后充分搅匀后再用(二)去

活

性采样后立即终止酶的活性常用方法：液氮速冻，微波照射，匀浆/沉淀，加酶活性阻断剂(氟化钠)或抗氧剂(VC),

煮沸2023/9/1

11□

前处理(分离，浓集，改性)为药物的测定提供条件

口

前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作1)体内样品预处理的目的2°常用体内样品预处理方法2023/9/1第

二

书体内样品分析的前处理一、体内样品前处理的目的3.改善2.满足

分析环境(前

处

理】

法仪器污染，劣化(去蛋白)

提高测定灵敏度/选择性化学改性(衍生化)血浆蛋白结合物；缀合物

使待测药物/代谢物释放

测定药物/代谢物总浓度样品介质组成复杂：

分

离待测组分浓度低：浓集2023/9/1

131.使待测

组分游离二、体内样品前处理的方法(一)去除蛋白质法(二)分离与浓集法

(三)

缀

合

物

水

解

法

(四)化学衍生化法2023/9/1●加入与水混

溶的有机溶剂，

蛋白析出

→药

物释放●乙腈，甲醇，

丙酮，四氢呋

喃等●血浆/血清与

有机溶剂的体

积比1:(2-3)1.

溶剂沉淀法(一

)去除蛋白质法

●热变性蛋白质沉淀●通常90℃●方法简单●只能除去热

变性蛋白●待测物热稳定性好4.热凝固法15●10%三氯醋

酸或6%高氯

酸溶液●血清与强酸

的比1:0.6●上清液呈强酸性(pH≤4)酸性分解的

药物不宜用●饱和硫酸铵，

硫酸钠，硫酸镁，

氯化钠等●血清与饱和

硫酸铵溶液的比

1

:

22.中性盐析法3.强酸沉淀法2023/9711.

液相萃取法2.

固

相

萃

取

法3.

超滤法(二)分离与浓集法2023/9/11.

液

相

萃

取

法

(1)

溶剂的

选

择

原

则(3)水相的pH(2)

溶剂的用量(4)提取操作2023/9/1溶剂紫

外

截

止

波

长(mm)沸

点

(

℃

)极

性

增

加

↓正己烷21069环己烷21081甲苯285111异

丙

醚

*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三

氯甲

烷

24561甲

基

异

丁

基

酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118②涕点低，易挥发；③与水不相混溶；④

无

毒

，

不

易

燃

烧

；⑤具有化学稳定和惰性；

⑥不影响紫外检测①辅助试剂的使用乙醚(1.2%水):氯化钠

②混合溶剂的使用正己烷-异丙醇(95:5)(1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶，对电离形式不溶；*:含过氧化物；

:肝脏毒性，有致癌作用182023/9/1(2)溶剂的用量●

有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1(3)水相的pH●

碱性药物pH高于pKa

1~2单位●

酸性药物pH低于pKa

1~2单位●

碱性下提取，可减少内源性物质(酸性)的干扰●

碱性下不稳定，在中性用三氯甲烷和异丙醇提取(4)提取操作●

提取1次●若提取回收率较低(低于50%),提取2~3次●

脂溶性干扰物，可进行小体积水溶液反提取2023/9/119(3)注

意

事

项(4)

固相萃取法的特点(2)

固相萃取法操作步骤(1)

固相萃取法的原理(5)自动化固相萃取2

.

固

相

萃

取

法普耗材专家L.cn泉岛公司-

http://woSepPak2023

/9/1AutoTrace工作流程的的作用，药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料)洗脱方式有两种：①冲洗溶剂洗去干扰物，再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；②药物直接被洗脱，干扰物保留柱预处理

样品添加

柱烧神

柱预处理

样品添加

柱洗涤分析物洗脱(1)固相萃取法的原理含药物体内样品通过小柱时，受到收

集分析物

分析物*

干扰物仪器偿息“吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和为色谱耗材专家q

andao.

com.cn(poly

t

iene.yseEReservoir泉岛公司-http

://

wwwSorbent

Bedstainlt

sfsio

t)eel

orns2023/9/1于抚物(2)固相萃取法操作步骤

●

第1步：甲醇润湿小柱，活化填料；净化填料●

第2步：水/缓冲液冲洗小柱，去除甲醇；甲醇含量

过低(低于5%)致C₁₈

链弯曲折叠，回收率降低●

第3步：加样，使样品通过小柱，并弃去滤过液●

第4步：水/缓冲液冲洗

Compounds

of

Interest小柱，去除内源性及其它

干

扰

物

质●第5步：洗脱溶剂洗脱待测物，收集洗脱液

活化，平衡

装样

淋洗

洗脱2023/9/1

22(3)注意事项●①样品(血浆)通过萃取柱的流速在

1-2ml/min;●②

冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；●③

萃取碱性药物时，洗脱剂中常加酸，有机胺，氨水，醋酸铵或离子对试剂2023/9/1

23固相萃取

(SPE)优势出众的净化，浓缩和溶剂转换出众的选择性和检测信号响应容易自动化大

体

积

净

化

/

Flash

分析优势·除盐和快速样品浓缩·

快速净化毫克几克分析样品液-液萃取——高通量样品制备优势·用自动化设备实现高通量相

对

廉

价·

需要的器具不贵蛋白沉淀盘(PPT)

高通量样品制备优

势·提高回收率，重现性和色谱柱寿命出众的消除蛋白和高分子物质能力·减小或消除蛋白

-

分析目标物非特异性结合过滤——高通量样品制备忧

势

,于

.

μm

的不溶性颗粒便2方0··(4)固相萃取法的特点缺点·

冗长的方法开发劳动

密

集型

方

式·

有限的分离可能性缺点·通常选择性较差·

样品浓缩需要过滤蒸发缺点·

非

特

异

性·更多的样品需要优化的2年法缺点·需要筛选不同的吸附剂

·方法开发需要较长时间快速浓缩10毫升-

1升样品到几毫升缺点·

相应的花费选

择

性●对于单个样品处理，SPE

操作省时●

对

于

大

量

样品的

处

理●半自动SPE:

萃取过程机械化●全自动化仪器：通过柱切换技术Detectar

Anelytical

columnIntermedatecolumn-wayaivaAutosamplerLinefilterPump

2forM

sap

etkan

fo

sophaarsaelone

prMobiaraasphmo(5)

自动化固相萃取法实

现

固

相

萃

取

与HPLC

联

用Pre-calumnway

vaivaPump

1盟想。登b~(5)自动化固相萃取法柱切换：固相萃取

-LC/MS/MS2.0

mL/minACQUITY

UPLC

BEH

色谱柱B

CLC进样0.4

mL/minACQUITY

BSM2023/9/1苹取柱

B间A:在线

SPE

LC/MS/MS

的进样阀

阀

B:

举取柱的切换院间

C:独立LC/MS/MS的进样间ACQUITY

QSM萃取柱

ASPE进样检测器2777c废液Ao

ultrafiltration是一种膜分离技术◎

按照截留分子量，选择半透膜，可分离30~1000kD

的可溶性生物大分子无化学试剂，无相变化技术参数浓

缩

管

容

量Sivaspin

20-水平转头20ml↵角转头14mL角转头(带压力盖时)15

ml规格e直径30

mm↵高

度116

mm,125mm(带压力盖时)有

效

膜

面

积6.0

cm²础留体积<20μl死体积50

μl材质样

品

浓

缩

管聚碳装酯法过液收集管聚碳毁配浓缩管盖聚内席压力盖乙

缩

整

/吕招法膜聚

(

P

E

S

)116简便，游离药物分析的首选方法；尤其适合TDM3.

超

滤

法50

μLef10mg/mL10

n4

30NaCl

在留分子量：3K/5K?10K/3050

μLof10

mgmL100

mMNaCl500

μL

of1mg/mL2Q23/9/1500

μL

of1

mg/mLprotan

in10mM

NaCl<50K/100K/300K/1000K0.2μm+Add450

μLof10mM

NnClorexchange

bufferprotein

inprotain

in100mM

Nacl10mM

NaC●葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶

●

专属性强●

时间较长●

可引入粘蛋白2.酶水解法●简便，快速

●

水解过程中

发生药物分解

●专一性较差1.酸水解法●

溶剂萃取过

程中缀合物(尤

其硫酸酯)直接

分解3溶剂解法(三)缀合物水解法●

测定尿药总量，水解缀合物●

趋向于直接测定缀合物2023/9/1281

.

在GC

中的应用(1)硅烷化：三甲基硅烷(TMCS)

(2)酰化：三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化：碘庚烷(C₇

H₁sl)(4)不对称衍生化：(S)-N-三氟

乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)2

.

在HPLC

中

的

应

用(1)衍生化的分类柱前/柱后；在线/离线(2)衍生化方法(1)紫外衍生化(2)荧光衍生化(3)非对映体衍生化●GC:

①提高药物的挥发性；②增加药物的稳定性；③生成非对映异构体●HPLC:

①提高检测灵敏度；②改善色谱分离(四)化学衍生化法容

量

分析法2023/9/1第

三

书体

内

样

品

分

析

方

法

与

方

法

验

证一、分析方法的建立二、分析方法的验证2023/9/1一

、分析方法的建立(一)分析方法的选择(二)分析方法建立的一般程序2023/9/1●

HPLC,GC●

HPLC-MSn,GC-MS●RIA,EIA,FIA;

适用于大分子●

TDM应用较多●

抗

生

素

生

物

利

用

度

，

等

效

性

，TDM

应

用

较

少32色

谱

分

析

法免

疫

分

析法牛勿

方法2023/9/1常用的检测方法：色谱分析法，免疫分析法和生物学方法(一)分析方法的选择●

待测物，内标(必要时)的标准物质●

色谱柱(填料),流动相，溶剂，进样量试剂/溶剂试验；生物介质试验

质控样品试验●

代谢产物对待测物，内标物的干扰

配伍用药的干扰33(二

)分析方法建立的一般程序●分析方法的建立和验证过程系同步进行●为便于讨论，以色谱分析法为例分别叙述1.色谱条件

的筛选2.色谱条件

的优化3

.

实际样品的测试2023/9/1(

一

)特异性(二)标准曲线与定量范围(三)定量下限(四)精密度与准确度(五)样品稳定性(六)提取回收率二

、分

析

方

法

的

验

证◎样品2023/9/1○方法(七)分析过程的质量控制(八)未知样品浓度超限的处理(九)药用内源性物质的测定(十)微生物/免疫学方法的验证(十一)名词解释二

、

分

析

方

法

的

验

证2023/9/1

3

5●其他■

分

析(一)特异性

●

特异性(specificity),

又称专属性或专一性，

通常与选择性(selectivity)互用山内源性物质●

比较标准物

质与6个不同个

体的空白生物

介质和QC

样品●软电离质谱

(LC-MS)

介质

效应2023/9/14.参比方法●

参比方法横坐标(x),拟定方法纵坐标(y),最xb

比例干扰(如，

标记抗原不纯，交叉

免疫)36a恒定干扰二乘

y=a+b●小2.未知代谢物●

比较QC

样

品和至少6个

不同个体用药

后的实际样品●

必要时LC-

DAD/MS确证

峰的单一/同一3.伍用药物●比较待测药

物，同服药物，

待测药物的QC

样品和添

加有同服药物

的干扰样品●线性回归：最小二乘法或加权最小二乘法●自变量(x)为药物浓度，因变量(y)为响应信号强度1.标准曲线的建立(1)系列标准溶液：n≥6(不包括0点);等比系列(2~3);通常为100~1000倍(2)内标溶液：浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度

(3)系列标准样品：空白生物介质，加入系列标准溶液(4)标准曲线的绘制：药物浓度，以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示2023/9/1

3

7(二)标准曲线与定量范围●少数方法(如，IA)

外，通常为线性模式(二)标准曲线与定量范围2.限度要求●通常用至少6个浓度建立标准曲线■非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点●定量范围覆盖全部待测样品浓度范围■定量上限(ULOQ)

高于用药后的峰浓度(C

max)■

定量下限(LLOQ)

低于Cmax

的10%~5%(1/10~1/20)●标准曲线各浓度点的回归计算值(x')与标示值(x)之间的

偏差〔bias=[(x'-x)/x]×100%〕

在可接受的范围之内■最低浓度点的偏差在±20%以内■其余浓度点的偏差在±15%以内2023/9/11.测定法取同一生物介质，制备至少5个独立的标准样品，其浓度

应使信噪比(S/N)

大于5,依法进行精密度与准确度验证2.

限度要求准确度应在标示浓度的80%~120%范围内，相对标准差

(RSD)

应小于20%(三)定量下限●定量下限(LLOQ):

标准曲线上的最低浓度点●符合准确度和精密度要求2023/9/1■(四)精密度与准确度●方法精密度除评价批内(日内)RSD

外，同时还应评价批间(日间)RSD1.测定法■

高中低3个浓度的QC

样品，制备至少5个独立的样品■低：LLOQ的2~3倍；高：ULOQ

的80%;中：几何平均浓度■同法独立测定3天2.限度要求准确度：低，80%~120%;中高，85%~115%RSD:

低，20%;

中高，15%2023/9/11.测定法(高低浓度)室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h)■

冷藏(4℃)数个工作日(标准储备液至整个分析完成)冷冻(-20℃/-80℃)至整个分析完成冻-融至少经历3个循环2.期限要求■短期：通常1工作日，不超过3工作日；长期：整个分析完成期限2023/9/1(五)稳定性

●

短期稳定性：在1个分析批内，样品室温等待处理；处理后溶液在

特定(HPLC

进室)温度等待进样期间稳定性●长期稳定性：在整个样品分析期间，体内样品的长期储藏，冻高融；

以及标准储备液的稳定性高中低3个浓度的QC

样品，制备至少5个独立的样品另取空

白

生

物

介

质

，

照QC样

品

同法

处

理

，

加

入

等

量

的标

准溶液(必要时除去溶剂)同法处理高中低3个浓度的标准对照样品(不含生物介质)(六)提取回收率

●

样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现；

而非待测物提取的完全与否1.测定法2.限度要求RSD:

低，20%;

中高，15%2023/9/1■■来自同一个体的体内样品在同一分析批中测定■每个分析批，建立批标准曲线；并随行3浓度QC

样品QC样品每个浓度至少双样本，并均匀分布在未知样品

顺序(低→高/高→低顺序均匀穿插整个分析批)中■一个分析批内未知样品数目较多时，应同时增加各浓

度QC

样品数，使QC

样品数大于未知样品总数的5%QC

样品测定结果的偏差不大于±15%,低浓度点偏差

不大于±20%;允许1/3非同浓度QC

样品结果超限不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废2023/9/1(七)分析过程的质量控制

■每个未知样品测定一次，必要时进行复测(

八

)

未

知

样

品

浓

度

超

限

的

◆标准曲线不能外延，浓度超限的样品处理后再测定■

浓

度

高

于ULOQ●

部分样品用空白生物介质稀释至规定体积再测定●同时制备浓度高于ULOQ

的QC

样品，同法稀释(浓度不低于LLOQ)后测定■

浓度低于LLOQ●增加样品体积(制备样品浓度高于LLOQ);

同法进

行QC

样品和空白介质试验●

特异性不降低，准确度和精密度符合要求●

生物利用度/生物等效性研究，不需处理2023/9/1(九)作为药用的内源性物质的侧定

)1.对生物介质进行处理2.

生物介质通过活性炭滤过、透析等技术去除所含

的该内源性物质后，作为空白生物介质使用2.

使用特定生物周期阶段的生物介质3.

适用于呈周期性变化的内源性物质(如雌激素)3.

使用替代介质如兔血浆，人血清蛋白，缓冲液，0.9%氯化钠溶液等；

测得的浓度需进行校正4.采用标准加入法适用于内源性物质含量较低的药物；结果为总浓度2023/9/1(十)微生物学/免疫学方法的验证■微生物学或免疫学分析法的标准曲线本质上是非线性

的，应尽可能采用更多的浓度点建立标准曲线■如果重复测定能够改善准确度，则应在方法验证和未

知样品测定中采用同样的步骤(如双样本分析)■微生物学或免疫学分析方法验证实验应包括在几天内

进行的6个分析批，每个分析批应包括4个浓度(LLOQ、

低、中、高浓度)的质控双样本2023/9/1标准物质(reference

standard):用于制备标准样品和QC

样品的待测物的参比标准●在结构上可以是待测物本身，也可以是其游离碱或

酸，盐或酯●常用的标准物质主要有三种来源：①法定标准物质

(如ChP标准品或对照品，USP标准品);②市售标准

物质(来自于具有良好信誉的供应商);或③分析实验室或科研机构自行合成和/或纯化的具有一定纯度的化合物■生物介质(biologicalmatrix):生物来源的物质，能以可

2023/9/1

重复的方式采集和处理；如血浆，血清，尿，粪，各种组缧(十一)名词解释1

■介质效应(matrixeffect):样品中存在除待测物以外的其他干扰物质对响应造成的直接或间接的影响■标准样品(standard

sample):在空白生物介质中加入

已知量待测物标准物质制成的样品●用于建立标准曲线，计算质控(QC)样品和未知样品

中待测物的浓度■

质控样品(quality

control

sample):即QC样品，在空白

生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的样品●用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性2023/9/1(十一)名词解释2品(未知样品)测试的人员(独立测试人员)在试验研究

的初始制备，并与未知样品在相同条件下同时保存●

制备QC

样品池时，不能使用制备标准曲线用的标准溶液，应另行制备(独立制备)●需制备额外的QC

样品时，应在初始制备的QC

样品

使用完之前制备，并与初始制备的QC样品同时测定，经检验应无显著性差异■

:未知样品(unknown

sample):

亦称研究样品(study

sample),是作为分析对象的体内样品2023/9/1(十一)名词解释3

■介质控样品池(pool

of

QC

sample):由不负责待测样(十一)名词解释4

■制备样品(processed

sample):

待测样品经过各步骤

(提取，纯化，浓缩等)处理，制成的直接用于仪器分析的试样分析批(Analytical

run/batch):

包括未知样品，适当数目的标准样品和QC

样品的完整系列●由于仪器性能的改善和自动进样器的使用，一天内

可以完成几个分析批；

一个分析批也可以持续几天完成，但连续测量不宜超过3天2023/9/1Thank

You!2023/9