无菌操作技术

项目三

无菌操作技术无菌操作技术教学内容：一、仪器设备与器具的使用二、外植体的消毒与接种三、继代接种操作技术

（一）灭菌设备（二）接种设备与用具一、仪器设备与器具的使用

1.湿热灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅）作用：用于培养基、玻璃器皿以及其他可高温灭菌用品的灭菌（一）灭菌设备手提式高压蒸汽灭菌锅卧式高压蒸汽灭菌锅

简易过滤器作用：用于赤霉素、玉米素、脱落酸等不耐热物质的灭菌。2.过滤灭菌设备3.干热灭菌设备作用：利用高温烘烤或灼烧的方法进行灭菌。酒精灯

接种器械灭菌器作用：对空气和物体表面进行消毒。紫外灯

臭氧发生器4.其他灭菌设备1.超净工作台植物组织培养的无菌操作设备。（二）接种设备与用具主要用于外植体接种或培养物继代转接。2.接种工具二、外植体的消毒与接种（一）外植体的选择（二）外植体的消毒（三）污染原因和预防措施（四）外植体的接种（一）外植体的选择1.外植体部位2.取材季节3.取材时间4.器官的生理状态和发育年龄5.选取适宜的大小1.外植体部位植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，这些部位包括：茎尖、茎段、表皮、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难脱分化，或者再分化频率很低。2.取材季节在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应3.取材时间避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采取的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。4.器官的生理状态和发育年龄植物上部器官的生长时间虽短，其生理年龄却较老，更接近发育上的成熟，越容易形成花器官。而越向基部，则生理年龄越小。下部组织越易形成营养器官，上部组织易形成花器官。通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力，容易培养，有较大的再生能力。5.选取适宜的大小材料太大易污染；材料太小，难于成活。

0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小（二）外植体的消毒

常用消毒药剂的使用和效果外植体的消毒步骤：外植体取材自来水冲洗70%乙醇表面消毒无菌水冲洗0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min无菌水充分洗净备用（三）污染原因和预防措施1、原因：（1）从病源菌方面：主要有细菌及真菌两大类；（2）从污染的途径：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底操作人员不规范工作环境带菌细菌污染的特点：菌斑呈粘液状，一般在接种后1～2天即可发现。原因：材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员操作不规范真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～5天才能发现。原因：周围环境不清洁超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大等操作不慎2、预防措施(1)减少或防止材料带菌

(2)外植体消毒要彻底

(3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌

(4)无菌室的灭菌

(5)操作人员严格遵守无菌操作的程序进行接种。灼烧工具（四）外植体的接种1.在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；

2.在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯；

3.接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；

4.上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面；

5.先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；

6.接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；

7.接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。接种操作是植物组织培养关键技术环节A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正

确

错

误防止操作带来的污染B、接种过程中尽可能达到悬空要求正

确

错

误C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正

确

错

误部分工作流程图片接种前的准备工作手的消毒台面的消毒材料的切割接种接种后盖上盖子三、继代接种操作技术

将诱导产生的芽、苗、愈伤组织、原球茎或胚状体等培养物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大培养的过程称为继代培养，也称为增殖培养。继代培养驯化现象和衰退现象驯化：植物组织经长期继代培养，会发生一些变化，开始继代培养要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长的现象。衰退：指长期继代培养的材料也会衰退，丧失形态发生能力，如生长不良，再生能力和增殖率下降等。影响继代增殖的因素（1）植物材料不同种类的植物，同种植物不同品种，同一植物不同器官和不同部位，继代繁殖能力也各不相同。一般是草本>木本；被子植物>裸子植物；年幼材料>老年材料；刚分离组织>已继代的组织；芽>胚状体>愈伤组织。在以腋芽或不定芽增殖继代的植物中，在培养许多代之后仍然保持着旺盛的增殖能力，一般较少出现再生能力丧失。（2）培养基和培养条件培养基因素例如：桃茎尖在MS培养基初次培养生长很好，继代培养在同样MS培养基则生长不良，而转入低NH4+和Ca2+，增加NO3-、Mg2+和P的培养基则能继代培养

。培养条件因素例如：桉树继代培养中发现如果总在23-25℃下培养，芽会逐渐死亡；但如果先在15℃下培养3天，再转至25℃下则可继代。（3）继代周期对一些生长速度快或者繁殖系数高的种类如满天星、非洲紫罗兰等，继代时间比较短，一般不超过15d。对生长速度比较慢的种类如非洲菊、红掌等，继代时间就要长一些，30～40d继代1次。继代时间也不是一成不变的，要根据培养目的、环境条件及所使用的培养基配方进行考虑。在前期扩繁阶段，为了加快繁殖速度，当苗刚分化时就切割继代，而无需待苗长到很大时才进行继代。后期在保持一定繁殖基数的前提下，进行定量生产时，为了有更多的大苗可以用来生根，可以间隔较长的时间继代，达到既可以维持一定的繁殖量，又可以提高组培苗质量的目的。（4）继代次数有的材料经过长期的继代可基本保持原来的