（建筑工程管理）基因工程改造秸杆发酵产氢的关键技术研究

）基因工键技术研究课题类型：探索导向类 申请受理编号：SQ2006AA05Z109513国家高技术研究发展计划（863计划）专题课题申请书中华人民共和国科学技术部2006-09-05序号姓名性别出生日期职务专业(人月课题组中职务或成员)的任务所在单位1程军男19748月无环境类24组长项目负责人浙江大学2谢斌飞女月无环境类30成员产氢代谢机理浙江大学3戚峰女19807月无环境类30成员秸杆发酵产氢浙江大学4张传溪男19601月长生物科学类18副组长基因改造理论浙江大学5刘建忠男19652月无环境类12成员高效产氢工艺浙江大学6李春雨男19735月无生物科学类12成员基因改造秸杆浙江大学7宋文路男19837月无生物科学类30成员产氢菌植入抗性基因浙江大学8鲍艳原女19686月无生物科学类30成员基因改造产氢菌浙江大学9苏会波男月无生物科学类30成员产氢菌剔除不利基因浙江大学10潘华引男19853月无环境类30成员秸杆高效水解浙江大学1041055050246奖情况，在国内外主要刊物上发表论文情况，完成其他科技计划课题情况，特别是近五年取得的和本申请课题相关的研究成果情况，字数要求1000字以内）家重点实验室副教授，研究领域为微生物制氢以及能源高效清洁利用。在微生物制氢领域作为项目负责人1项全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目、1120012004微生物法产氢研究，提出了发酵法联产氢气和甲烷的新工艺，探索了发酵和光合耦合法高效产氢体系，且对秸杆生长细胞和产氢菌株的基因工程改造进行了可行性研究，使系统的能源转化率获得突破性提高，取1960119851991Ph、PKEPO统中的表达”被评为全国优秀博士学位论文。1998年浙江大学应用昆虫研究所任教授、副所长。2001.5-2003.8年日本学术振兴会特别研究员。现为浙江大学分子生物学实验室教授、博导，主要从事分子生物学和基因工程研究。近年来除从事病毒基因功能研究外，仍致力于原核和真核表达、产氢菌株的基因工程改造研究，在产气肠杆菌剔除乳酸基因片段和表达产氢酶基因方面取得了壹定的研究成果。学术兼职：应邀任美国国家自然科学基金会（NSF）41“863“973100（SCI322542.2课题组长、副组长目前承担863计划和其它国家科技计划课题情况（包括人员姓名、承担课题名称、课题经费数、课题起止时间、所属科技计划名称等信息）姓名承担课题名称课题经费数(万元)课题开始时间课题结束时间所属科技计划张传溪基因工程表达AChE及其在绿色农药先导物筛选应用502003-9-12008-8-30973程军城市固体有机废弃物以微生物发酵法联产氢气和甲烷研究242005-1-12007-12-30其他说明事项：程军副教授负责的该国家基金项目和本次申请863项目的研究目的和内容完全不同，可是都属于微生物发酵产氢研究领域，所具备的科研支撑条件、主要仪器设备以及积累的发酵产氢理论知识和实践经验，能够为本次项目的顺利完成提供良好的平台。张传溪教授负责的该973项目二级课题和本次申请863项目的研究目的和内容完全不同，可是都属于基因工程研究领域，所具备的科研支撑条件、主要仪器设备以及积累的基因工程理论知识和实践经验，能够为本次项目的顺利完成提供良好的平台。2.3课题组长及课题组主要成员是否曾就相同或类似课题863计划和国家其他科技计划提出申请（如有，请说明申请人姓名、申请科技计划名称、申请课题名称、申请时间、申请结果等情况，且说明和本课题申请的关系）无。究内容、预期目标等，字数要求1000字以内）乏以及燃烧对环境产生的巨大危害要求人类加速研发洁净高效和可再生的新能源。由于氢气具有很高的能量密度，燃烧产物是水，且且没有污染性，而以氢的制备、储存和利用为内容的研究开发已成为世界各国竟相争夺的高科技制高点之壹。另壹方面，我国农村存在量大面广的废弃生物质，如秸秆用生物质能成为我国经济社会可持续发展的迫切需求。利用秸杆等生物质以微生物法制取氢气对发展清洁高效的可再生能源和减少环境污染具有重要意杆等生物质高效降解成可资利用的仍原糖是利用其发酵产氢的首要技术难点和重大关键点。而其能否获得产业化应用的瓶颈问题是过程的经济性，（对活体植物茎杆本身无害）的纤维素酶和Enterobacteraerogenes（ldh）等基因，抑制产氢细菌drogenaseEnterobacteraerogenespH氢菌的发酵产氢能力和能源转化率获得突破性提高。课题主要研究技术国内外专利申请和授权情况需要消耗大量化石燃料和能量、且且产生大量污染的弊病。目前在生物法制氢研究方面主要分为发酵法和光合法俩大类，（尤其是葡萄糖的有机废水，对于主要由复杂大分子有机质即不溶性的2001-2004140ml/g180ml/g，而厌氧活性污泥的接种产氢速率可高达45ml/（了壹些探索性研究，取得了壹定的研究成果。众多专家壹致认为：如何使生物质及固体废弃物高效降解成可资利用的仍原糖是利90℃左右水解过程中不需要酸碱预处理和外加纤维素酶等，🖂玉米、甘蔗等植株生长过程中表达纤维素酶和半纤维素酶，以获得更有利于秸秆高效水解的农作物，但至今很少见到公开的文献酶分为放氢酶和吸氢酶，分别催化反应的正逆反应。作为壹种有机金属酶类，氢酶对氢代谢至关重要，研究其基因结构和空间结100EnterobactercloacaeIITBT08得到测序，可是关于其附属基因、调控机制仍不清楚。梭菌的铁氢酶已经成功的克隆，且异源表达到光合细菌内，强化了光合菌大的研究探索空间。无论是纯种仍是混菌培养，提高关键菌株产氢效率都是最重要的工作。单纯的条件优化手段已不能满足这壹内的氢酶种类繁多，通过敲掉基因片段的方法是壹个可行策略。Lindblad[3]AnabaenaPCC7120工程手段对氢酶进行强化，包括增加其活性、耐氧性也都是可行策略。效产氢突变株，且提高菌种对环境的耐受力，在高产氢菌种的选育中耐高温或耐酸菌是值得重视的壹个育种方向。有报道对产气了48％[4]。任南琪教授在其CSTR反应器中分离出壹株产氢发酵细菌ZGX4，以其为出发菌株，对其进行紫外和亚硝酸复合诱变选产23％[5]（2molH2/mol2.2molH2/mol[6]。产氢细菌进行改造的研究目前在生物制氢领域仍没有展开，是很值得深入研究的方向。JonathanWoodWard[7]10工构建代谢途径对于产氢的巨大潜力。可是这壹方法目前仍只能在体外进行，成本相当高。通过细菌的代谢工程改造和控制，将、丙酮酸途径和NADH途径。其中NADH途径是最具开发潜力的方向，多篇文献中提到提高NADH的含量是有利于产氢的。目前普NADHNADHFADH2NADH道了从梭菌Clostridiumparaputrificum中得到壹种具有特殊碱基序列的氢化酶基因，将其植入寄主细胞进行基因重组可提高产氢通DNADNAWO2006062130[12]在壹株含有甲酸盐脱氢酶甲酸的产氢量。美国专利仅有壹篇关于改造藻类基因强化其光合作用产氢的报道，中国专利主要集中于氢酶的鉴定和基因测序，pressionofbiologicallyactiveAcidothermuscellulolyticusendoglucanaseintransgenicmaizeplants.PlantScience,2006(Inprelationandmolecularcharacterizationofhydrogenasegenefromahighrateofhydrogen-producingbacterialstrainEnterbactercloahotoproductionofH2bywildtypeAnabaenaPCC1720andahydrogenuptakedeficientmutant;fromlaboratorytooutdoorculture.InaserirradiationonhydrogenproductionbyEnterobacteraerogenes.InternationalJournalofHydrogenEnergy(inpress).高效产氢菌株.第六届全国氢能学术会议论文集.2005；11：137.s.FeasibilitystudiesonthefermentativehydrogenproductionbyrecombinantEscherichiacoliBL-21.ProcessBiochemistry41(200ductionfromstarchbyamixedcultureofClostridiumbutyricumandEnterobacteroerogenes.BiotechnologyLetters,1998,20:143-14enproductionbyfermentationandatrialforimpromentontheyieldofhydrogen,HydrogenenergyProgress.ProceedingsoftheNinthWoy.HydrogenproductionbyFacultativeAnaerobeEnterobacteraerogenes.Plenumpress[M].1998:273-279andMethodforProducingHydrogen，公开号：JP2003102482oorganismCapableofHighlyProducingHydrogen，公开号：JP62134091edgeneparticipatinginhydrogenproductionabilityandmethodofproducinghydrogenbyusingthemicroorganism，公开号：WO20060创新点，现有研究基础中转入纤维素酶和半纤维素酶等基因，在获得高产量稻谷的同时又能获得在加工过程中被自身产生的纤维素酶和半纤维素酶高效水氢的反应动力学，对其进行纯化、分离和鉴定，研究其生理生态学特征以及最佳的代谢反应条件。terobacteraerogenes（ldh）等基因，抑制产氢细菌在代谢过程中形成乳酸等的有效途径，从而达到加强产氢途径在产氢细菌中转入[Fe]-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平，进壹步增强产氢效率。的产氢酶重组入非产氢抗性菌的基因组，获得耐酸性和其它对环境耐受力强的产氢菌株。NADHpH酵产氢量、速率和浓度等，探索实现其最大能源转化率的控制原理。因片段，导入产氢酶[Fe]-hydrogenase达到植物细胞壁的自身降解，省去传统方法中的酸或碱预处理。通过转基因在植物中表达纤维素酶和运用表达纤维素结合蛋白改[Fe]-hydrogenase点实验室在生物质能源化利用方面具有深厚的研究基础，在生物质的能源化高效转化和清洁利用方面取得了突出业绩。申请者程军作，曾经承担和参加了多项国家及省部级重大科研项目，具有较强的科研工作能力，且积累了丰富的研究经验。在生物质及固体有11研究了产气肠杆菌在不同固定化条件下的发酵产氢特性；研究了富含碳水化合物、蛋白质和脂肪等三类大分子有机质的废弃食物发氢特性的影响规律；研究了以厌氧活性污泥为接种物时各种反应条件对水葫芦发酵产氢的影响规律。提出了壹种发酵法联产氢气和7秆发酵产氢的预处理方法研究，太阳能学报，2006（已录用），富含三类大分子有机质的废弃食物发酵产氢特性，浙江大学学报（工学版，2006（已录用）等，不同来源的活性污泥对稻草发酵产氢影响的实验研究，浙江大学学报（工学版，2006（已录用程军等，秸秆发酵产氢的影响因素研究，环境科学，2006（已录用）引，戚峰等，污泥和水葫芦混合发酵产氢的影响因素分析，武汉理工大学学报，2006（已录用）程 军 ， 谢 琳 ， 谢 斌ydrogenproductionfromsolidorganicwastesbyheat-shockdigestedsludge.Proceedingsofthe8thAsianHydrogenEnergyConference.大学农业生物学院分子生物学实验室张传溪教授和鲍艳原副教授长期从事分子生物学和基因工程研究，对多种病毒进行基因组分研究，发表了壹系列SCI收录文章。在细菌和病毒基因组基因剔除研究方面，建🖂了高效的ET重组系统和pBAD-gba-A重组系统,BacmidBm79,Bm118、Bm9,chitinase定的研究成果。浙江大学种质创新和分子育种平台具有良好的分子育种条件，是“211”和“985”建设平台。目前高标准的水稻300良研究，直接和生物质能转化有关的研究包括：1）植物细胞壁降解酶（polygalacturonaseandpectinesterase）的分离和克隆了成功表达纤维素酶的转基因水稻苗。因此，本课题组对于产氢细菌和水稻秸杆的基因改造研究具有深厚的专业理论背景和扎实的专利等知识产权及人才培养情况基因水稻，获得能被自身植株生长产生的酶高效水解为仍原糖的秸秆。筛选培养高效产氢菌株，通过knockout技术，剔除产氢形成乳酸等的有效途径；同时通过克隆[Fe]-hydrogenase[Fe]-hydrogenase产氢效率。设计出高效产氢反应器且优化其运行条件，使转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢能力和能源转化率获得突破性除和导入，抑制产氢细菌代谢通道中乳酸等不利于产氢的代谢途径，增强产氢酶[Fe]-hydrogenase的基因表达水平，从而获得高50%之上。4施方案）及其可行性分析（如有协作单位，请说明课题的任务分工）在植物中表达荧光蛋白质和纤维素结合蛋白的融合蛋白质，使其和纤维素结合，从而使秸秆中的纤维结构发生变化。因融合蛋白质中表达抗高温纤维素酶和半纤维素酶，表达了这些酶的农作物秸秆在收获过程中或者其后经过高温（90℃左右处理，供更好的起始材料。分离和鉴定。通过分子生物学中应用成熟的细菌ET重组修饰系统，转入产氢细菌，构建可重组产氢细菌。克隆产氢细菌EnterobaT系统在产氢细菌中转入[Fe]-hydrogenase基因，提高产氢酶表达水平，进壹步增强产氢效率。通过CAT抗性标记，筛选重组的改造后产氢细菌的产氢效率和性状。的产氢酶重组入非产氢抗性菌的基因组，获得耐酸性和其它对环境耐受力强的产氢菌株。研究转基因新型产氢菌的发酵产氢机制接为氢酶提供仍原力，以增强其产氢效率。杆水解产物的发酵产氢代谢过程，及时抽取发酵气，以防止氢分压过高对酸化过程造成抑制作用。对各个阶段产氢反应器的终端气势和温度等参数对产氢过程的影响，优化反应器运行条件。研究转基因秸杆接种转基因产氢菌的发酵产氢量、速率和浓度等，探索州大学Davis分校、杜邦X公司和SyngentaX公司等正在加紧研究在玉米、甘蔗等植株中表达纤维素酶和半纤维素酶，以获得更有歇根州🖂大学的最新研究成果，将纤维素酶通过电击转入玉米中得到转基因植株，在叶片的总可溶性蛋白质中纤维素酶含量达到2通过转基因表达纤维素酶进行了多年富有成效的研究，承担了相关的国家杰出青年基金和国际合作项目，目前已经成功获得表达为在微生物制氢研究领域国际上最新的热点课题，已引起许多研究机构的高度重视且成为技术竞争的制高点之壹。本课题组长期蛋白互作等进行了深入的研究。建🖂了高效的ET重组系统和pBAD-gba-A重组系统，且在大肠杆菌中构建了杆状病毒人工染色体，ETEnterobacteraer