木寡糖的研究

木寡糖的研究PAGEPAGE16 木寡糖的研究

摘要：研究从啤酒酵母中提取和提纯蔗糖酶的方法技术。采用菌体的自溶的方法来破碎细胞壁后菌体分离提取蔗糖酶液，再经过热提取、乙醇沉淀和QSepharose柱层析法纯化蔗糖酶。通过蔗糖酶水解蔗糖测定各种提纯液的酶活；用Folin-酚试剂法和微量凯氏定氮法测蛋白含量并比较两种方法优缺点；再用SDS测定蛋白质的相分子量。通过对实验数据的分析得出用乙醇提纯液总活力最高，所含蔗糖酶比例最大蔗糖酶(Sucrase，EC3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍在工业上具有较高的经济价值。（1）以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。（2）目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多（3）

从中可以看到，每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过Nelson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有的酶活力单位。

啤酒醉母中含有丰富的蔗糖酶，本实验以它为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀柱层析等步骤提取蔗糖酶．并对其性质进行测定。

除非特别说明，所有的纯化步骤均在0－4℃之间进行。细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（externalyeastinvertase）,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internalyeastinvertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取

。酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的Km值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。Km值反映了酶和底物亲和能力的强弱程度，Km越大表明酶与底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。

酶的活力就是酶所催化的反应的能力，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定．但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。为了准确表示酶的反应速度通常采用初速度表示。

2.3.5小结112.4.1用灭菌含乳饮料（含木寡糖）做得大鼠112.4.2得到结果12-152.4.3小结2.4.4终结153.1木寡糖改善狗肠道菌群的研究14-153.1.1得到结果154.1讨论155.1木寡糖的应用前景16-18参考文献19致谢20课题研究目的和研究意义研究目的：（1）提纯的一般原理和步骤（2）机溶剂分级和透析技术（3）掌握柱层析的原理和方法（4）学会3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的原理和操作方法（5）了解底物浓度和酶反应速度之间的关系（6）掌握测定米氏常数的原理和方法研究意义：酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究种具有重要意义。啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母作为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶。并对其活力进行测定。蔗糖酶主要存在于酵母中，但工业上通常从酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。以此可得到较高纯度的酶。

蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5min,每产生l毫克葡萄糖所需酶量。用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。

1材料与方法1.1材料与仪器

1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。

95%乙醇（分析纯）

QSepharose

葡萄糖标准液（自配）0.2mg/ml

Folin-酚试剂

浓硫酸

2%硼酸溶液2克硼酸溶于蒸馏水，稀释至100ml

0.01N标准HCL

30%丙烯酰胺贮液：称取丙烯酰胺29.2克，甲叉双丙烯酰胺0.8克，先用80毫升双蒸水溶解，搅拌再用双蒸水稀释至100ml，过滤。

10%TEMED：0.1mlTEMED+0.9ml双蒸水

10%SDS：25克SDS用双蒸水溶解至250ml,室温保存。

标准蛋白质：兔磷酸化酶B，Mr97400;牛血清蛋白，Mr66200；兔肌动蛋白，Mr43000；牛碳酸酐酶，Mr31000；DHG－9000A型电热恒温鼓风干燥箱上海益恒实验仪器有限公司SHZ－B水浴恒温振荡器上海跃进医疗器械厂TU－1810紫外可见分光光度计北京普通用仪器有限责任公司THZ－82A台式恒温振荡器上海跃进医疗器械厂电热恒温水浴锅上海跃进医疗器械厂BSZ－100自动部分收集器离心机DYY-III-8B稳压稳流型电泳仪上海青浦西仪器厂TGL－16G型高速离心机上海精密科学仪器有限公司QBio－SepFF层析柱玻璃3．0cm×25．8cm北京生科瑞达科技发展有限公司胰蛋白酶抑制剂，Mr20100；移液枪（20040096）Mr14400使用试剂均为分析纯。1.2方法

1.2.1蔗糖酶的提取和初提纯

1.2.1.1细胞破碎

在500ml三角瓶中加入鲜酵母20克，醋酸钠1.6克，搅拌15-20分钟，使团块的鲜酵母液化，加1.5ml甲苯用软木塞塞好，摇匀放在37℃培养60小时

1.2.1.2蔗糖酶的提取

初提液A

在培养箱中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加10毫升蒸馏水，摇匀，用离心机离心10分钟，转速15000转/分。取中间层再离心8分钟，取上层清夜保存。

热提取液B

将初提液A倒入50毫升的三角瓶中，加3.2毫升4N醋酸，使溶液PH为4.5左右，摇匀，50℃水浴，保温30分钟，取出后迅速在冰浴中冷却，在15000转/分钟下离心8分钟。

乙醇沉淀提取液C

将热提取液B倒入100毫升的烧杯中并至于冰浴中，搅拌下加入（-20℃）95%乙醇溶液，体积与热提取液B相同，整个过程约35分钟。离心8分钟，离心速度15000转/分，倒掉清夜用5ml,0.05MTris-HCL,PH7.3缓冲液将固体溶解，离心8分钟，取清夜保存。

1.2.2蔗糖酶的纯化

实验采用QSepharose柱层析法，QSepharose凝胶高约10厘米。通过盐度发生器使缓冲液的盐度渐变。每管收集3毫升直至洗脱液用完。用葡萄糖测验试纸测试每管酶活力取最高两管为D液。

1.2.3蔗糖酶的活力测定

酶的活力大小通常是以该酶在最适PH，温度等条件下催化底物水解，经一定时间后，以反应物中底物的减少或产物形成来表示。用测还原糖的量来算酶的活力。本法用3.5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物的显色原理测糖含量。葡萄糖标准曲线

试管号012345葡萄糖00.801.001.201.401.60蒸馏水3.002.202.001.801.601.403.5-二硝基水杨酸1.501.501.501.501.501.50总体积4.504.504.504.504.504.50酶活力的测定

初提液A（1：200）热提取液B（1：200）乙醇提取液C（1：100）柱分离D（1：20）

空白样品空白样品空白样品空白样品酶液ml2.002.002.002.002.002.002.002.002NaOH0.5000.5000.5000.5005%蔗糖溶液35℃水浴预热，每管加蔗糖液2ml准确计时3分钟，然后在样品管加0.50ml2NNaOH.540NM波长处测OD值。

1.2.4Folin-酚测蛋白浓度[6]

按表加试剂做标准曲线（660NM）

012345牛血清蛋白ml00.20.40.60.81.0H2O4.54.34.13.93.73.5试剂A1.01.01.01.01.01.0试剂B第一次0.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.2总体积6.06.06.06.06.06.0初提液A（1：100），热提取液B（1：100）乙醇提取液C（1：20），D不稀释。从中各吸取0.5ml进行蛋白质含量测定。

1.2.5微量凯氏定氮法测蛋白含

消化取0.5mlB液加2克硫酸钾-硫酸铜混合物，5ml浓硫酸反应一个半小时左右溶液呈淡蓝色。定容至50ml

凯氏定氮用2%硼酸溶液10ml及混合指示剂4滴作为指示液，每次取5ml消化液和10ml30%NAOH溶液放入凯氏定氮仪中。待反应终点用0.01NHCL滴定。

1.2.6SDS测蛋白质的相对分子量

配置12%的分离胶：缓冲液2.5ml，30%丙烯酰胺贮液4.0ml，10%SDS0.1ml，10%过硫酸铵溶液0.1ml，加水3.3ml，10%TEMED40ul

配置浓缩胶：浓缩胶缓冲液0.5ml，30%丙烯酰胺贮液0.67ml，10%过硫酸铵溶液40ul，加水2.7ml，10%TEMED40ul

加A，B，C，D四种样品进行电泳，然后染色，脱色。

2结果与讨论

2.1.蔗糖酶的提取和初提纯

实验得到初提液A18.1ml，热提液B20.0ml，乙醇沉淀提取液C7.7ml。本法采用化学自溶法破细胞壁，时间长但效果好。实验中应尽量避免高温，防止酶失活。

计算公式：VA总=VA

VB总=VB（VA/VA—3）

VC总=VC（VB总/VB—3）

2.2蔗糖酶的纯化

共收集到24管测280nm下，管数与OD值关系曲线如图

吸光度最高的两管为D液共37.73ml.

计算公式：VD总=VD*VC总/V样

由于被吸附的物质不一定是所要求的单一物质，所以除了选择正确的洗脱液外，还采取控制流速和分部收集的方法来进行收集。因不同物质的极性不同，容易交换的先流出来，根据顺序收集。

离子交换层析,蛋白质对离子交换剂的结合力取决彼此间相反电荷基团的静电吸引,而这又与溶液PH有关,盐度的微小变化会直接影响他对蛋白质的吸收。所以可以改变溶液中的盐离子强度和PH来实现。柱内压力大则流速快，洗脱效果不好；离子浓度大则洗脱快，但效果不好。因此提高分离效果的条件是：合适的流速，合适的离子交换剂及离子洗脱浓度。

2.3蔗糖酶的活力测定

样品V测（ml）V总（ml）稀释倍数N总活力UA0.218.120010507B0.220.02008454C0.27.71004770D0.337.73203498计算公式总单位活力数=mg/V测*4.5/2*V总*n

实验标准曲线：

通过制作葡萄糖标准曲线，以及酶活力的测定，计算出酶的总活力单位数。A,B,C,D的总活力单位数呈递减趋势。可能原因：经过一步步提纯，蔗糖酶的纯度不断提高，其他的一些杂酶及同工酶不断被除去。

2.4Folin-酚测蛋白浓度

蛋白标准曲线如图1

初提液A热提取液B乙醇提取液C柱分离DOD6600.4860.3100.3600.564V总（ml）16.518.98.245.92稀释倍数100100211总mg蛋白（mg）470.60247.1619.088.10比活力（u/mg）22.3334.20250431.8纯化倍数1.531120.1933回收率（%）52524.051.7计算公式总mg蛋白=(mg/0.5)nV总

比活力=总活力单位/总mg蛋白

总mg蛋白数ABCD呈递减趋势，A，B和C，D之间的递减幅度较少，而B，C很大，比活力，纯化倍数，回收率变化趋势类似。说明热提取过程中除去了一小部分杂蛋白，而乙醇提取过程除去了大部分。蔗糖酶在溶液中含量是微小的，说明了酶具有高效性。

该方法的优点：灵敏度高，样品中蛋白含量5ug以上即可测定。缺点：抗干扰性能差，蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格，不同蛋白中Tyr和Trp含量有差异导致显色不同。

2.5微量凯氏定氮法测总氮

用0.0102NHCL滴定三次结果：0.41ml，0.42ml，0.44ml。取平均值为0.42ml，样品含氮量=15.79mg。样品总蛋白98.71mg

计算公式样品含氮量=A*Nhcl*14.008*50*5.3/5*0.2

样品总蛋白=样品含氮量*6.25

上次用Folin-酚测的为19.08mg,本次明显偏大。

可能原因：凯氏定氮法测量要比Folin-酚法测更精确，Folin-酚法抗干扰性能差，蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格，不同蛋白中Tyr和Trp含量有差异导致显色不同。同时本实验使用的tris-hcl含氮，影响结果

2.6SDS

测蛋白质的相对分子量

A67500597005500046100378003350023400

B63800566004750033300

C6750045600

D无法测量

1．A，B，C的条纹数逐渐减少，说明样液中蛋白质的种类逐渐减少，因为经过逐步提纯，种类不断减少

2ABC相对分子质量不断减少，说明分子质量大的颗粒大，通过凝胶洞所受阻力大，移动慢。而分子质量小的受阻力小，容易扩散。

3．一些由亚基或2条以上肽链组成的蛋白质，它们在SDS的作用下，解离成亚基或单条肽链，故对这些蛋白质，测定结果只是亚基或单条肽链的，须用其它方法测定

3.结论

整个实验由蔗糖酶的提取和初提纯，蔗糖酶的纯化（QSepharose柱层析法），蔗糖酶的活力测定，Folin-酚测蛋白浓度，微量凯氏定氮法，SDS测定蛋白质的相对分子质量六部分组成。初提纯中，乙醇沉淀法提取所得的酶总活力最高，比活力也比较高，经过QSepharose柱层析法法后进一步提高。测酶的蛋白质含量时凯氏定氮法比Folin-酚法更精确。用SDS电泳测蔗糖酶的相对分子量时凝胶能使标准蛋白中不同分子量的分子很好的分开，通过与标准曲线的对比求出相对分子质量。

参考文献：

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