细菌的标本片制备及染色课件讲解

动物微生物

http://娄底职业技术学院任务3

细菌抹片的制备及染色一、目的要求

1、了解细菌简单染色法和革兰氏染色法的原理。

2

、掌握细菌抹片技术及几种常用染色法的操作步骤。二、原理

由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别细菌。三、器材

1、大肠杆菌、葡萄球菌18-24h液体培养物和斜面培养物

2、美兰染色液，革兰氏染色液

3、载玻片、接种杯、酒精灯、染色架、吸水纸、蜡笔、擦镜纸、显微镜、香柏油等四、内容和方法（一）细菌抹片的制备1、涂片方法

（1）菌落涂片方法：用经酒精灯火焰灭菌过的接种环，蘸取生理盐水1滴于载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直径1－1.5cm大小均匀的抹片，此膜应既薄又均匀为好，待干即成。（2）菌液涂片法：用灭菌接种环蘸取菌液1－2接种环，均匀涂抹再载玻片上，呈直径1－1.5cm左右的圆形涂膜，自然干燥后备用。（3）组织涂片方法：先用镊子夹持组织局部，以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。2、干燥涂片最好在室温自然干燥。必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查。3、固定（1）火焰固定将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰3－4此，以标本片不烫手为度。放置冷却后，进行染色。（2）化学固定血液、组织脏器等抹片做姬姆萨染色或单染色时，不能用火焰固定。可将干燥的抹片浸入甲醇2－3min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2－3min，自然挥发干燥。抹片做瑞特氏染色时则不必做特别固定，染色液中含有的甲醇可以达到固定的目的。抹片固定的目的：（1）使菌体蛋白凝固附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。（2）杀死细菌以改变细菌对染料的通透性。（3）能杀死抹片中的部分微生物。（二）细菌常用的染色方法

1、简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。如。美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染色液，经1－2min，水洗，沥去多余的水分，吸干或烘干（不能太热），然后镜检2、复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加助染剂进行染色的方法。染色后不同细菌和物体或细菌结构的不同部分科呈现不同颜色，有鉴别细菌的作用。如革兰氏染色法、抗酸染色法和姬姆萨染色法等。革兰氏染色法：（1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2min，水洗。（2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，1-3min，水洗。（3）加95%乙醇于抹片上脱色，约30s至1min，水洗。（4）加石炭酸复红液复染1-2min，水洗。（5）吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。葡萄球菌G+菌----蓝紫色大肠杆菌G-菌----淡红色五、思考题

1、革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？

2、细菌为何在染色前固定？

3、试述革兰氏染色的原理和步骤。

4、绘出你所观察到的细菌形态。附：载玻片处理载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，如有残余油渍，可按下列方法处理。

1.滴上95％酒精