注射剂中热原的特征、检测方法、污染途径及去除方法研究

摘

要：介绍了注射剂中热原的特征、检测方法、污染途径及去除方法，为制药企业在实际生产过程中如何防止热原污染和灵活选择去除热原的方法提供了参考。关键词：热原；特征；检测方法；污染途径；去除方法

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引言热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质，它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”是指细菌性热原（细菌内毒素），它是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及其内毒素，即细菌性热原是由细菌在生长、繁殖过程中产生的代谢产物以及细菌死亡后从细菌尸体中释放出的内毒素等混合而成，主要成分是由磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物，其中的磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强，其化学组成因菌种不同而有所差异，分子量为5×104～5×105，分子量越大，致热作用越强。当细菌存在于药液中，并具备细菌生长繁殖的条件时，如有水分、温度与酸碱度适宜细菌生长、有足够的营养物质，细菌就会快速生长繁殖，就有可能产生热原。大多数细菌和霉菌都能产生热原，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰氏阳性杆菌类，革兰氏阳性球菌则较弱，此外，霉菌、酵母菌甚至病毒也能产生热原。当注入人体的注射剂中含有的热原量达1μg/kg时，就可引起不良反应，发热反应通常在注入1h后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。鉴于注射剂中的热原对人体的危害极大，本文将对热原的特征、检测方法、污染途径和去除方法进行研究总结。

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注射剂中热原的特征1.1

水溶性热原能溶于水，其浓缩液往往有乳光。1.2

耐热性热原在60℃干热1h条件下不受影响，100℃时也不会分解，在120℃干热4h条件下能被破坏98%左右，在180～200℃干热180min、250℃干热30min、350℃干热5min、650℃干热1min条件下则可被彻底破坏。而通常采用的注射剂湿热灭菌条件，不能破坏热原。1.3

滤过性热原体积小（长度1～5nm），能通过一般的除菌过滤器，不能被截留除去，但用小于1nm孔径的微孔滤膜或超过滤器滤过，则可滤去绝大部分甚至全部热原。1.4

不挥发性热原本身不挥发，溶于水，但可随水蒸气的雾滴夹带入蒸馏水中，故蒸馏水器均设隔膜装置。1.5

可吸附性热原能被活性炭、白陶土、硅藻土等吸附，但属非特异性吸附，药物也会被吸附造成损失。此外，热原还可被离子交换树脂，尤其是阴离子交换树脂所交换而除去。1.6

可破坏性热原可被强碱、强酸、氧化剂等破坏，故可用强碱或强酸、清洁液来处理带热原的容器具。

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注射剂中热原的检测方法2.1

家兔法由于家兔对热原的反应与人基本相似，因此，家兔法是各国药典规定的检查热原的法定方法。2015版《中国药典》规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。家兔法检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/mL，试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐、费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂的热原检测。2.2

细菌内毒素检查法（鲎试剂法）细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。细菌内毒素检查方法包括凝胶法和光度测定法两种，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/mL，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制以及家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂的检测，但其对革兰氏阴性菌以外的内毒素检测不灵敏，鲎试剂法尚不能完全代替家兔法。鲎试剂法中使用的鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原、凝固蛋白原，是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1，3）-β-葡聚糖。鲎试剂法是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，它简单、快速、灵敏、准确，因而被欧美药典及我国药典定为法定的内毒素检查法，并已被世界各国所采用。3

注射剂中热原的污染途径3.1

生产过程中操作人员带入在注射剂的生产过程中，操作人员如果不按要求进行着装和操作，就有可能污染经过处理的生产环境、生产设备及附属系统和药液，进而把热原带入注射剂中。3.2

生产过程中生产设备及附属系统带入在生产注射剂时，生产注射剂的设备、管道、过滤器、容器、用具等，使用前未彻底清洗、灭菌和除尽热原，均有可能污染注射剂。3.3

原辅料带入某些原辅料，如中药提取物、蔗糖、含蛋白为主的生物制品等，由于细菌容易繁殖而引起热原污染。原辅料被热原污染的原因有很多，如包装不符合要求、包装出现破损或贮存时间长久，以及许多药品本身适于微生物生长，所以在选用原辅料时应多加注意。3.4

由溶剂带入注射用水含热原是注射剂中热原的主要污染途径。由于蒸馏器结构不合理、操作不当、容器不洁净、放置时间过久等都会引起热原污染。在注射剂的配制过程中，溶剂最好是新鲜制备的，如注射用水贮藏时间过久，被细菌污染后，细菌很快繁殖，短时间内可产生大量热原，虽然随后还会进行灭菌操作，但是已有热原存在，不易除去，因而易产生热原反应。因此，配制注射剂时应使用新鲜注射用水，最好随制随用，2010版GMP规定注射用水可采用70℃以上保温循环的方式存放。3.5

由生产工艺带入如果生产工艺中制定的去除热原的参数，如温度、时间、酸碱浓度、膜孔径等制定不正确，将无法彻底除去生产设备及附属系统、接触药液的内包装材料和药液半成品中的热原，进而造成注射剂受热原污染。3.6

生产过程中的环境带入注射剂的整个生产过程要求在规定的洁净环境中进行，尽可能减少微生物污染的风险。注射剂的洁净生产环境按2010版GMP的规定，一般分为A级、B级、C级、D级，如果生产环境不符合GMP要求，就会增加微生物污染的风险。3.7

临床应用前带入注射剂成品在保存及运输过程中，由于操作不当，造成注射剂的内包装损坏，污染注射剂进而产生热原。3.8

从输液器中带入有时注射剂本身虽不含热原，但注射后却有热原反应，这很可能是由于输液用具受污染产生热原，输液用具包括一次性输液器、一次性输液管等。3.9

在注射过程中带入（1）在输液过程中加入其他药物时，所加药物本身已被污染，产生热原；（2）加药时操作室的洁净度差，环境不符合要求，消毒及注射操作方法违规；（3）加药后放置时间长，增加了污染的风险。

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注射剂中热原的去除方法4.1

利用热原的水溶性去除热原4.1.1

密闭的生产设备系统采用在线清洗/灭菌的方法，用新鲜注射用水在线清洗15min、121℃在线灭菌15min的方法建立无热原、无菌的密闭的生产设备系统。4.1.2

生产用容器具不能在线清洗/灭菌的生产用容器具，可用新鲜注射用水清洗15min、湿热灭菌柜121℃灭菌15min或者115℃灭菌30min的方法，确保容器具无热原、无菌。利用在线冲洗和在线灭菌相结合的方式去除热原，虽然操作方便，但是会浪费大量的注射用水。4.2

利用热原不耐干热的特性去除热原对耐受高温处理的制药用生产用容器具，可采用180～200℃干热180min、250℃干热30min、350℃干热5min的方法清除生产用容器具的热原。4.3

利用热原体积小的特性去除热原采用小于1nm孔径的微孔滤膜或超过滤器过滤药液，可除去液体内的热原。4.4

利用热原的可吸附性[3]去除热原通常药液里的热原可选用优质活性炭（针剂用）、白陶土、硅藻土进行吸附。但是，使用活性炭吸附热原时需要注意以下事项：（1）活性炭的临界吸附温度为45～50℃，当温度低于临界吸附温度时，活性炭的吸附效力较差，除需冷藏和不便加热的药液外，使用时一般药液经加热煮沸后吸附15～30min，再冷却至45～5O℃过滤脱炭，脱炭最好在短时间内完成，以免温度下降或在放置过程中发生脱吸附作用，使制剂杂质增多。（2）活性炭的用量应视原料质量、品种而定，常用量为0.1%～0.5%（W/V）。若用量不足，对杂质、热原等不能完全吸附；若用量过大，其所含的水溶性杂质可对药液造成污染，影响制剂质量。活性炭的用量与活性炭的吸附力、活性炭对药物的吸附力、溶媒的性质、药物的结构等因素都有关系。活性炭在水中比在有机溶媒中的吸附力强；对极性基团多的化合物的吸附力大于对极性基团少的化合物；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对分子量大的化合物吸附力大于分子量小的化合物。因此，对主药含量低或主药易被活性炭吸附的制剂，活性炭的用量最好控制在0.05%（W/V），并通过计算适当增加主药投料量。4.5

利用热原大分子上含磷酸根与羧酸根的特性去除热原热原这类大分子上含磷酸根与羧酸根，往往带有负电荷，故易被强碱性阴离子交换树脂所交换，可采用离子交换法除去药液中的热原。4.6

利用热原可被强碱、强酸、氧化剂等破坏的特性去除热原可使用强碱或强酸来处理带热原的制药用生产设备及附属系统、容器具，具体方法是使用低浓度的强碱（如1%的氢氧化钠溶液）或强酸对配液罐及其管道、容器具浸泡8h，用高浓度的强碱（如10%的氢氧化钠溶液）或强酸对配液罐及其管道、容器具进行擦拭，存放8h，就可以除去生产设备及附属系统、容器具上的热原。这种去除方法的缺点是浪费时间，优点是能够节省大量的注射用水。4.7

利用凝胶过滤法去除热原凝胶可作为分子筛，利用热原与药物分子量的差异，将两者分开。但当两者分子量相差不大时，不宜使用该方法。4