L-酪氨酸的酶法合成及分析

L-酪氨酸的酶法合成及分析L-酪氨酸的酶法合成及分析方案的制定--------夏小落一、L-酪氨酸背景知识英文名：L-Tyrosine学名：2-氨基-3-对羟苯基丙酸。一种含有酚羟基的芳香族极性α氨基酸。是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸。符号：YCASNo.：60-18-4产品描述：白色结晶体或结晶粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸或稀硝酸中溶解生产标准：AJI92，USP26，EP4分子式：C9H11NO3相对分子量或原子量：181.20密度：1.456熔点〔℃〕：l:342～344〔分解〕；d:310～314(分解)；dl:340〔分解〕比旋度：-11.3°至-12.1°【性状】l-体从水中结晶出来者，无色至白色丝光针状结晶或结晶性粉末；d-体从水中结晶者为无色晶体；dl-体从水中结晶者为有光泽的针状晶体。为动物体内非必需氨基酸！【制备或来源】⑴由含蛋白质的物质〔废丝、酪蛋白和玉米等〕水解液中提取；⑵以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得；⑶以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用β-酪氨酸酶催化制取。L—酪氨酸的结构式【用途】与糖类共热可产生氨基羰基间的反响，而产生一种特殊的香料。必需氨基酸。酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化装品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。白癜风患者吃含有酪氨酸的食物可以促进黑色素的形成，减轻白癜风病症。医药用作甲状腺功能亢进；食品添加剂。是一种重要的生化试剂，是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料。广泛用于农业科学研究，也作饮料添加剂和配制人工昆虫饲料。二、L-酪氨酸的酶法合成L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase，TPL，EC4．1．99．2)，也称β-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。TPL催化L-酪氨酸裂解的最适pH为8．2，pH6．0时该酶根本没有活性。一般认为这种高、低pH情况下的酶活差异是由于pKa约为7．8的二种催化碱的质子化引起的。酪氨酸酚裂解酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体中，其中酶活较高的微生物主要是草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、中间柠檬酸菌(Citrobacterintermedius)、弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)以及嗜热菌Symbiobacteriumthermophilum和Symbi-obacteriumtoebii等。近年来，来源于上述微生物的TPL，其空间结构和作用机制已得到较深入研究，并在工业化应用方面取得重要进展。三、实验原理

TPL由4个相同的亚基组成。Demidkina等将每个亚基分成N-末端臂、小结构域、大结构域及结构域间的连接区等四个局部。TPL的催化活性需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)作为辅因子。每个亚基含有1个PLP结合位点，该位点位于一个亚基大、小结构域与结晶学相关的另一亚基大结构域之间形成的深裂内。TPL的催化活性还需要单价阳离子K+或NH4+作为激活剂。每个亚基含有1个K+结合位点，该位点位于结晶学相关的二个亚基之间相联系的界面上，具有稳定催化二聚体的作用。K+的配位数为7，它们是一个亚基Gly52和Asn262的羧基氧、另一个结晶学相关亚基Glu69的主链羧基氧与侧链羧基氧，以及三分子水。Phillips等认为，Lys256紧邻PLP结合位点Lys257，在单价阳离子结合位点的形成中具有关键作用。不同阳离子与配位体在距离上的微小差异，引起了活性部位构象的细微改变，这可能是不同阳离子对TPL活性具有不同效应的原因。TPL的作用机理TPL催化的β-消除反响机制主要包括以下步骤:酶活性部位Lys257的ε-氨基与PLP共价结合形成内醛亚胺，内醛亚胺与底物L-酪氨酸作用形成外醛亚胺，Lys257夺取外醛亚胺(底物)Cα质子产生醌型中间物，经底物Cγ质子化及Cβ-Cγ键断裂生成α-氨基丙烯酸中间物，α-氨基丙烯酸中间物进一步受与PLP结合的Lys257ε-氨基攻击再生TPL全酶四、TPL在L-酪氨酸酶法合成中的应用TPL可用于生产L-多巴、L-酪氨酸及其衍生物。日本味之素(Ajinomoto)公司于1993年首先采用TPL生产L-多巴，其工艺是以E．herbicolaTPL催化邻苯二酚、丙酮酸和氨合成L-多巴，可积累L-多巴110g/L，并生产出将近世界年产量(250吨)一半的L-多巴。但是，这一工艺需在E．herbicola的培养基中添加L-酪氨酸以诱导表达TPL，而L-酪氨酸和L-多巴理化性质相近，从而造成别离纯化困难和生产本钱增加。 相关的重要进展是Koyanagi等应用DNA改组技术筛选出携带突变型调节基因TyrR的E．herbicola，其TPL在无L-酪氨酸诱导时可积累L-多巴11．1g/(L·h)，而野生型TPL在有L-酪氨酸诱导时仅为0．375g/(L·h)，生产率提高了30倍。用TPL生产L-多巴已实现工业化20年，而用TPL合成L-酪氨酸尚处于研发中。五、工艺路线

工艺路线一L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产L-酪氨酸具有重要的应用价值。用TPL合成L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。Para等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C．intermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立75mmol/L丙酮酸钠、45mmol/L硫酸铵、45mmol/L氯化铵和55mmol/L苯酚的转化体系，反响5h后可积累L-酪氨酸10g/L。假设将反响体系置于连续的柱反响器内，苯酚对L-酪氨酸的转化率达90%，且稳定性可维持5d。工艺路线二L-丝氨酸路线。由于L-丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶(EC2．1．2．1)催化甘氨酸和甲醛廉价制备，Lee等用产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)和E．HerbicolaATCC21434分别作为丝氨酸羟甲基转移酶和TPL的酶源，将以甘氨酸为底物合成L-丝氨酸的反响和以L-丝氨酸为底物合成L-酪氨酸的反响相偶联，反响体系含甘氨酸0．25mol/L、PLP0．5mmol/L、四氢叶酸0．7mmol/L、初始苯酚浓度0．32%，以37%甲醛启动反响16h后，可产生L-酪氨酸26．3g/L，甘氨酸转化率为61．4%，但该工艺存在甘氨酸对TPL抑制较强和操作复杂的明显缺乏。工艺路线三S-邻硝基苯-L-半胱氨酸(SOPC)是TPL适宜的人工底物，其Vmax比生理底物L-酪氨酸高三倍，而Km仅为L-酪氨酸的50%。Phillips等以C．FreundiiATCC29063细胞悬液作为酶源，4mmol/LSOPC和4mmol/L苯酚反响2h，苯酚的转化率就到达70%，而且这一反响的最适pH较为宽泛(6．8～9．0)。不过，SOPC价格较高，从而限制了该工艺的工业化应用。丙酮酸和L-丝氨酸对TPL均具有较高的Km值，需在反响体系中过量参加，不仅导致产率降低，而且引起产物别离困难。L-酪氨酸的分析一、分析测定酪氨酸—酪氨酸的测定—电位滴定法本方法适用于酪氨酸的含量测定。方法原理：供试品加无水甲酸溶解后，再加冰醋酸适量，照电位滴定法〔附录ⅦA〕，用高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕相当于18.12mg的C9H11NO3。电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，和直接电位法相比，电位滴定法不需要准确的测量电极电位值，因此，温度、液体接界电位的影响并不重要，其准确度优于直接电位法普通滴定法是依靠指示剂颜色变化来指示滴定终点，如果待测溶液有颜色或浑浊时，终点的指示就比较困难，或者根本找不到适宜的指示剂。电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往连续变化n个数量级，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过消耗滴定剂的量来计算。使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定，氧化复原滴定，配合滴定和沉淀滴定。酸碱滴定时使用PH玻璃电极为指示电极，在氧化复原滴定中，可以从铂电极作指示电极。在配合滴定中，假设用EDTA作滴定剂，可以用汞电极作指示电极，在沉淀滴定中，假设用硝酸银滴定卤素离子，可以用银电极作指示电极。在滴定过程中，随着滴定剂的不断参加，电极电位E不断发生变化，电极电位发生突跃时，说明滴定到达终点。用微分曲线比普通滴定曲线更容易确定滴定终点。如果使用自动电位滴定仪，在滴定过程中可以自动绘出滴定曲线，自动找出滴定终点，自动给出体积，滴定快捷方便。进行电位滴定时，被测溶液中插入一个参比电极，一个指示电极组成工作电池。随着滴定剂的参加，由于发生化学反响，被测离子浓度不断变化，指示电极的电位也相应地变化。在等当点附近发生电位的突跃。因此测量工作电池电动势的变化，可确定滴定终点。试剂：水〔新沸放置至室温〕，冰醋酸，无水甲酸，高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕，基准邻苯二甲酸氢钾，无水冰醋酸，结晶紫指示液仪器：烧杯，玻棒，电子天平，棕色试剂瓶，滴定管、滴定池、指示电极、参比电极试样制备：1.高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕配制：取无水冰醋酸〔按含水量计算，每1g水加醋酐5.22mL〕750mL，参加高氯酸〔70~72%〕8.5mL，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。假设所测供试品易乙酰化，那么须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%~0.2%。标定：取在105℃枯燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。⒉结晶紫指示液取结晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解。贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。操作步骤：取该品约0.15g，精密称定，加无水甲酸6mL溶解后，加冰醋酸50mL，照电位滴定法〔附录ⅦA〕，用高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液〔0.1mol/L〕相当于18.12mg的C9H11NO3。注1：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一,“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。注2：“水分测定”用烘干法，取供试品2~5g，平铺于枯燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称取，翻开瓶盖在100~105℃枯燥5小时，将瓶盖盖好，移置枯燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度枯燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量〔%〕。二、分析鉴定纸层析法分析鉴定酶法合成的L-酪氨酸实训原理纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得到别离的方法。纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。

溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离=X/Y在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法别离氨基酸。操作流程平衡显色展层点样准备滤纸计算结果显色计算结果实验器材〔1〕层析缸〔2〕毛细管：5只/组。〔3〕培养皿：1只/组。〔4〕层析滤纸〔长16cm、宽16cm的〕：1张/组。〔5〕直尺、铅笔：自备。〔6〕电吹风：1只/组。〔7〕针、白线：1套/组。〔8〕小试管：4只/组〔9〕移液管等常规仪器〔10〕喷雾器实验试剂1.展层剂和平衡液正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液(弃去)。2.样品液用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液，以及