PCR引物设计及Primer-Premier-5.0使用介绍

PCR引物设计及相关软件使用主要内容PCR介绍引物设计原理引物设计原那么PrimerPremier5.0介绍举例说明引物的设计PCR介绍1、什么是PCR聚合酶链反响(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期开展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不适宜的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带〔如形成引物二聚体带〕，不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计原理引物设计的目的是为了找到一对适宜的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。引物设计的原那么1.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度〔primerlength〕常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反响；引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的〔不容易引起错配〕引物设计的原那么2.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。GC含量〔composition〕过高或过低都不利于引发反响。上下游引物的GC含量不能相差太大。假设按公式Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估计引物的Tm值，那么有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最正确。引物设计的原那么3.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。4.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。引物设计的原那么引物设计的原那么5.碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否那么容易导致错误引发〔Falsepriming〕。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。引物设计的原那么7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否那么引物自身会折叠成发夹结构〔Hairpin〕使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应防止3′端的互补重叠以防止引物二聚体〔Dimer与Crossdimer〕的形成。引物设计的原那么引物二聚体及发夹结构如果不可防止的话，应尽量使其△G值不要过高〔应小于4.5kcal/mol〕。否那么易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反响不能正常进行。引物设计的原那么7.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。引物设计的原那么8.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件〔比方RNAstructure〕可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。引物设计的原那么9.引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分适宜的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

PrimerPremier5.0简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence根本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为总分值每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的