（高清版）GBT 21606-2022 化学品 急性经皮毒性试验方法

代替GB/T21606—2008,GB/T27823—2011化学品急性经皮毒性试验方法国家标准化管理委员会GB/T21606—2022 I Ⅱ l2规范性引用文件 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 l3.2缩略语 4试验方法 24.1动物种属选择 24.2饲养条件 24.3动物准备 24.4试验内容 5试验数据和报告 45.1试验数据 45.2试验报告 附录A(规范性)试验需要考虑因素 6附录B(规范性)检测程序流程图剂量范围预试验 附录C(规范性)检测程序流程图正式试验 参考文献 I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替GB/T21606—2008《化学品急性经皮毒性试验方法》和GB/T27823—2011《化学品急性经皮毒性固定剂量试验方法》,与GB/T21606—2008和GB/T27823—2011相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)增加了“规范性引用文件”一章(见第2章);b)更改了“术语、定义和缩略语”(见第3章，GB/T21606—2008和GB/T27823—2011的第2章);c)将“试验基本原则”“试验原则”更改为“试验需要考虑因素”,设定为附录A(见附录A,GB/T21606—2008的第4章和GB/T27823—2011的第3章);d)更改了附录“预试验流程图”和“正式试验流程图”内容(见附录B和附录C,GB/T27823—2011的附录A和附录B);e)删除了GB/T21606—2008的第3章、第5章～第8章、规范性附录B和附录D,删除了GB/T27823—2011的规范性附录C。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、中国检验检疫科学研究院、中检科健(天津)检验检测有限责任公司、厦门丰力扬科技有限公司、广东义胜检测有限公司。向小云。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：——GB/T21606—2008;——GB/T27823—2011;——本次为第一次修订。Ⅱ根据科学发展和动物福利保护的要求，需要对化学品试验指南进行定期回顾考查和更新。近期，重要相关期刊汇总分析了数百种农药和千余种工业化学品的急性经口、急性经皮毒性试验结果，发现大于或等于98%的物质，基于急性经口毒性试验数据所进行的危害分类等同或高于源自急性经皮毒性试验数据的分类结果。由此可见，依据急性经皮毒性试验所进行的分类对于急性经口毒性试验数据源性的物质危害分类具有一定的预测价值和相关性。随着毒理学毒性替代方法技术的不断更新，已发布的经皮毒性试验方法GBT21606—2008和GB/T27823—2011亟需修订和校正。及时修订是必要的，原因——公认单性别(常为雌性)试验证据充分；——为增加单一急性经皮毒性LD₅的数据价值，需进一步明确置信区间(CI);——依据全球化学品统一分类和标签制度(GHS)的原则，设置充分适当的剂量范围有助于受试物的危害分类。传统方法在评价急性毒性时常以动物死亡作为唯一毒性终点。1984年，英国毒理学会提出选择固定剂量进行受试物染毒的方式。该方法有效避免了仅以动物死亡作为观察终点的弊端，将几个固定剂量中的某个剂量出现的明显中毒症状作为观察终点，该剂量作为受试物的毒性分级依据。本方法也采用上述设置固定剂量的方式。此次文件的更新是基于生物统计分析结果，通过对多个急性经皮毒性试验方案的评估和比较后确认最优化的试验方案。本方法借鉴急性经口毒性固定剂量法和急性毒性分级的试验方案进行层级化设计，并综合分析实验动物的死亡率和/或濒死状态开展受试物的急性经皮毒性评价。本试验方案具有高复现性、动物使用数量少等优点。本方法可提供受试物的危害性质信息。对于可引起急性经皮毒性的受试物，可根据本试验结果，按照全球化学品统一分类和标签(GHS)的原则，对受试物进行急性经皮毒性的分级和分类。1GB/T21606—2022化学品急性经皮毒性试验方法1范围本文件规定了化学品急性经皮毒性固定剂量试验方法的术语、定义和缩略语、试验方法、试验数据和报告。试验需要考虑因素依据附录A。本文件适用于固定剂量法测试化学品的急性经皮毒性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB14925实验动物环境及设施3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1术语和定义急性经皮毒性acutedermaltoxicity受试物在短时间内(24h以内)一次性经皮染毒所产生的有害作用。剂量dose给予受试物的量。注：表示为实验动物单位体重所给予的受试物量(如，mg/kg)。动物在死亡或垂死状态出现前的一种表现。注：啮齿类动物临近死亡的表现包括抽搐、侧卧、斜卧和震颤等(详见人道终点指南文件No.19)。半数致死量medianlethaldoseLD₅₀由统计学方法推导出的受试物通过染毒途径暴露可以引起50%动物出现死亡的剂量。注：LD₅值用实验动物单位体重的受试物质量(mg/kg)表示。试验的上限剂量。2在即使给予治疗的情况下，动物仍然即将死亡或无法存活的状态。注：详见人道终点指南文件No.19。可预见的死亡predictabledeath出现的临床表现提示动物一定将在试验结束之前的某个时间死亡。注：例如，丧失了饮水和进食的能力。指被检测的物质。3.2缩略语GHS:全球化学品统一分类和标签制度(GloballyHarmonizedSystemofClassificationandLabelingofChemicals)UVCBs:未知或有多种组成成分的物质、复杂的反应产物或生物材料(ChemicalSubstancesofUnknownorVariableComposition,ComplexReactionProductsandBiologicalMaterials)4试验方法4.1动物种属选择4.1.1优先选择健康成年大鼠。常规的急性经口和急性吸入毒性试验研究表明，性别之间的敏感性差异通常不大，但在存在性别差异时，雌性动物通常更为敏感。但若化学结构相似物质的毒理学或毒代动力学信息表明雄性动物更敏感，则应选择雄性动物，并予以说明。4.1.2应选择毒性试验中常采用的动物种属。雌性动物应未孕未产。用于染毒的每一只动物应为成年动物(8周龄～10周龄),体重(200g～300g),且体重应在已染毒动物平均体重的±20%内。动物应4.2饲养条件动物实验室的温度应保持在20℃~26℃的范围内。相对湿度维持在40%～70%。采用人工照明，12h明、暗交替。采用常规实验室饲料喂养，自由饮用无菌水(依据GB14925)。4.3.1在开始染毒前至少适应性饲养5d,出于动物福利考虑应使用群体笼养。试验中应随机选择动物并编号标记。4.3.2染毒前一天，应仔细去除受试动物背部或侧面的毛(去毛面积至少为体表面积的10%)。按需麻醉动物，以便在试验操作中易于控制并减少应激反应。应注意避免动物皮肤擦伤(以免改变皮肤渗透性)。确定去毛和受试物涂覆区域时应考虑动物体重。受试物应尽可能均匀地涂敷在动物背部及侧面皮肤的去毛区(去毛面积至少为体表面积的310%)。受试物为高毒时，涂敷表面积可适当减小，但应尽可能使受试物涂抹均匀、覆盖轻薄。在24h接触期内，应使用多孔纱布覆盖，再用无刺激性胶布固定，确保受试物与皮肤接触。还应以适当方式进一步覆盖染毒部位，防止纱布脱落并避免动物舔食。必要时，在不影响动物活动的前提下，可使用适当约束装置。在24h接触期内，可将动物分笼饲养，以避免笼中其他动物舔食受试物。当受试物为固体时，应将其充分研磨及与适量赋形剂混匀(常使用水，但必要时可选择其他适宜的赋形剂),确保受试物与皮肤良好接触。当使用其他赋形剂时，应考虑赋形剂对受试物皮肤渗透性的影响，应记录赋形剂的使用量(通常为0.5mL～1mL)。液体受试物一般不需稀释。在24h接触期结束时，应用水或其他溶剂去除残余的受试物。除特殊原因(例如，由于严重毒性作用，与其他动物接触可能会增加痛苦或可加剧局部皮肤反应)外，结束皮肤受试物接触的动物应群体饲养，尽量减少分笼饲养的时间。4.4.2动物数量及剂量水平在正式试验中，每个剂量组使用2只动物，按照流程依次染毒。通常，急性经皮毒性未知或较高(例如：LDo<200mg/kg),未达豁免标准，需进行急性经皮毒性试验。当受试物信息不足或缺失时，宜以200mg/kg为起始剂量，对一只动物进行毒性剂量范围的预试验，最大程度地减少实验动物的数量并优化试验设计(依据附录B中毒性剂量范围预试验流程图)。根据毒性剂量范围预试验的结果，按录C流程图中的试验方案，对另外2只动物进行正式试验，以确定毒性的分类结果。该试验设计具有生物统计评估数据的支持，通过比较大量试验方案与其各自分类预测的结果，验证了其可信性，即在正式试验中只需2只动物即可对受试物进行正确分类。若受试物信息充分，但仍不能豁免试验时，则应基于全球化学品统一分类和标签制度(GHS)急性经皮毒性分类，选择其他起始剂量(例如：50mg/kg、1000mg/kg或2000mg/kg)以及相同试验方案(先进行毒性剂量范围预试验，随后进行正式试验)。动物的染毒时间间隔取决于中毒症状的出现、持续时间和严重程度，最少间隔48h。直到确认染毒动物存活，再对下一个剂量组的动物染毒。所有实验动物的观察期至少为14d。动物于染毒后30min内至少观察一次，并在24h内定时观察，尤其需要注意2h～6h的反应，此后每天观察一次，共观察14d。但具体观察期应取决于毒性反应的性质、出现时间、发生率及持续时间等。毒性反应的发生和结束时间非常重要，尤其是在出现迟发毒性反应时，需要具体判断并准确记录。应系统记录所有观察结果，对每只动物单独记录具体表现。对处于濒死状态、严重痛苦和/或具有持久痛苦表现的动物，应及时实施安乐死。尽可能准确记录安乐死动物的时间以及动物发现死亡的时间。观察内容应包括动物皮肤和皮毛、眼睛和黏膜的变化，呼吸、循环、植物性神经系统和中枢神经昏迷等情况。此外，可进一步在清除受试物24h、48h和72h时根据Draize标准观察染毒部位的情况，以便为皮肤刺激试验提供有效信息。应在染毒前、染毒后(至少每周一次)、试验结束处死前称量动物体重。所有实验动物(包括试验中死亡的动物或人道处死的动物)都应进行大体解剖检查。应记录每只动4物的大体病理变化。对首次染毒24h或更长时间后仍存活的动物，可考虑对其产生异常的组织、器官或染毒部位进行病理组织学检查，以便提供更为细化的支持信息。5试验数据和报告5.1试验数据5.1.1应提供个体动物的数据。所有数据均应以表格形式汇总，并说明各剂量组使用的动物数量、产生毒性症状的动物数量、试验过程中发现死亡或安乐处死的动物数量、每个动物的死亡时间、毒性效应的描述和时间进程及其恢复情况、动物的解剖结果等。5.1.2遵照附录B和附录C中所述，应确定受试物的分类。流程图展示了以起始剂量开始试验的具体步骤。根据毒性剂量范围预试验，按以下三种方式之一开展正式试验：a)在相同剂量水平下进行试验以确认分类结果；b)在较高剂量水平下进行试验；或c)在较低剂量水平下进行试验。基于动物福利的考虑，正式试验中无需重复使用毒性剂量范围预试验中的致死剂量。正式试验中各剂量组采用额外的2只动物以证实受试物合适的危害分类。5.2试验报告5.2.1体内试验的基本原理及现有试验数据的综合分析已有的相关试验结果描述。列出每一步测试的数据。所开展的体内试验操作的权重分析。可知的受试物自身稳定性。可知的受试物在赋形剂中的溶解性和稳定性。单一组分物质：a)物理性状和其他相关的理化性质(例如，酸/碱属性);b)鉴别资料，包括国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)或美国化学文摘服务社名称(CAS名称)、CAS号、简化分子线性输入规范(SMILES)或国际化合物标识编码(InChI编码)、分子结构式；d)实际可行的杂质成分鉴别等。多组分物质，未知或有多种组成成分的物质、复杂的反应产物或生物材料(UVCBs)和混合物：尽可能地提供受试物的化学成分鉴别资料(如上所述),混合物中各组分的定量和相关的理化性质。5.2.3赋形剂(如果适用)需说明使用赋形剂的理由，选用的赋形剂不是水时也应说明理由。5动物数量、周龄和性别(如使用雄性，需说明不选用雌性的理由)。饲料和饮水的质量等详细信息(包括饲料的种类/来源、饮水的来源)。动物随机分组的方法。受试物的详细成分，包括染毒时所用的受试物的物理性状。给予受试物染毒的详细信息，包括染毒量、染毒面积和染毒时间。选择起始染毒剂量的理由。列表体现每只动物的毒性表现和染毒剂量(例如，死亡情况、毒性表现的性质、严重程度和持续时间等)。列表体现动物体重和体重的变化情况。每只动物染毒当天的体重、染毒后每周的体重、死亡及安乐死时的体重、试验过程中死亡动物的死亡日期和死亡时间。每只动物毒性表现的时间过程，以及是否可以恢复。若有可能，提供每只动物尸检和组织病理学的检查结果。如对皮肤刺激性进行进一步分析，使用Draize标准进行评估。资料解释过程。5.2.7结果讨论和解释6(规范性)试验需要考虑因素A.1除非与受试物潜在经皮毒性相关数据的权重证据分析具有明确的经皮毒性的指向性，一般情况下，急性经皮毒性试验不作为首选试验。试验前，应充分了解受试物的所有信息，包括化学物的特征、化学结构、理化性质、其他体内外毒性试验结果、现有定量构效关系(QSAR)数据和其他结构相关物质的毒性数据；受试物的可能用途、人群暴露的可能性和试验测试数据的用途。该信息有助于提供测试依据和选择适当的起始剂量。本方法剂量设计的原则为使用预期中等毒性的剂量，避免使用预期的致死剂量。A.2本试验的目的在于估测受试物的急性经皮毒性剂量范围，化学物质的分类信息应与分类和标签规范一致。急性经皮毒性试验所提供的信息仅限于特定靶器官，而急性毒性的评价则不限于单一靶器官，需汇总分析急性毒性各个试验终点后作出综合性的判定。对于急性经皮毒性的试验结果需要具体问题具体分析，明确该试验结果对于急性毒性评价的具体价值和意义。A.3出于动物福利的考虑，尽量避免采用具有腐蚀性或严重刺激性的受试物剂量。受试物的pH值和缓冲能力(酸/碱储存量)可提供相关参考信息。体外试验可用于检测受试物的潜在腐蚀性。濒死动物或极度痛苦的动物应被人道处死，并应在解释试验结果时将其等同于试验中死亡的动物。处死濒死动物或极度痛苦动物的准则以及辨别动物是否濒死的准则详见相关指南文件。A.4若开展本试验，应同时考虑受试物对于局部和系统的影响。经皮毒性试验中明确的皮肤刺激性证据(例如，3级或4级红斑和/或3级或4级水肿)可明确受试物具有皮肤刺激作用，无需再进行其他验证性试验。A.5对混配产品(包括杀虫剂、生物杀灭剂和其他配制产品)的综合评估提示，这类产品的急性经皮毒性很少大于急性经口毒性。实际上，在大多数情况下(99%),皮肤毒物的LD₅o≥2000mg/kg。因此，若经口LD₅o>2000mg/kg,则豁免急性经皮毒性试验，以减少动物的使用数量。此外，通过对比体内试验数据与GHS计算数据(参阅GHS第3.1.3章混合物分类标准),基于各成分的急性毒性估计值(ATE)对混合物进行计算分类，这些数据的一致性>98%(没有低估，即假阴性),因此提供了豁免经皮毒性试验的另一方法。虽然混合物中的各成分间一般不产生协同作用，但仍应考虑混合物中各成分相互作用所致毒性的可能性。A.6根据附录B的内容设置合适的固定剂量组，受试物采用单性别动物逐步染毒。根据受试物的现有信息，可能需要进行毒性剂量范围预试验(例如：受试物的现有信息很少或缺失)。初始剂量应选择可能产生明显的毒性反应而不会引起严重的毒性作用或死亡的剂量。根据是否存在毒性反应或死亡的情况，在后续试验中适当增加或降低剂量。A.7将受试物按照不同剂量水平涂布于实验动物的皮肤上，每组使用一个剂量。随后，观察毒性作用和动物的死亡情况。对试验期间死亡的动物应及时进行大体解剖，在试验结束时处死其他所有动物并进行大体解剖检查。综合分析观察结果对受试物进行危害分类。7(规范性)检测程序流程图剂量范围预试验剂量范围预试验流程见图B.1。开始★50mgkgABABA结果AB图B.1剂量范围预试验流程8(规范性)检测程序流程图正式试验正式试验流程见图C.1。开始*2只动物G[[S类别分类12233445朱分类结果AB无显著毒性且无死亡2只动物B2只动物200mg/kgB→全部死亡2只动物50mg:kg图C.1正式试验流程9[1]Thomas,H.D.andDewhurst,I.C.(2007).Whatdoesadermalacutetoxicitystudyaddtotheinformationonaplantprotectionpesticide?Toxicol.231,114-15.[2]Creton,S.,Dewhurst,I.C.,Earl,L.K.etal.(2010).Acutetoxicitytestingofchemicals—Opportunitiestoavoidredundanttestingandusealternativeapproaches.Crit.Rev.Toxicol.40,50-83.[3]Seidle,T.,Prieto,P.andBulgheroni,A.(2011).Examiningtheregulatoryvalueofmulti-routemammalianacutesystemictoxicitystudies.ALTEX28,95-102.[4]Indans,I.,Fry,T.,Parsons,P.,etal.(1998).Classificationandlabellingofnewindustri-alchemicalsforacutetoxicity,skinandeyeirritation.Hum.Exp.Toxicol.17,529.[5]Seidle,T.,Robinson,S.,Holmes,T.etal.(2010).Cross-SectorReviewofDriversandAvailable3RsApproachesforAcuteSystemicToxicityTesting.Tox.Sci.116,382-96.[6]Moore,N.P.,Andrew,D.J.,Bjerke,D.L.etal.(2013).Canacutedermalsystemictytestsbereplacedwithoraltests?Acomparisonofroute-specificsystemictoxicityandhazardclassi-ficationsundertheGloballyHarmonizedSystemofClassificationandLabellingofChemicals(GHS).Reg.Toxicol.Pharmacol.66,30-37.[7]OECD(2016).GuidanceDocumentonWaivingorBridgingofMammalianAcuteToxicityTests.DraftdatedJanuary2016.SeriesonTestingandAssessmentNo.237,Environment,HealthandSafetyPublications,OECD,Paris.[8]BritishToxicologySocietyWorkingPartyonToxicity(1984).Sproachtotheclassificationofsubstancesandpreparationsonthebasisoftheiracutetoxicity.HumanToxicol.3,85-92.[9]OECD(2002).OECDGuidelineforTestingofChemicals:AcuteToxicClassMethod(No.423).OECD,Paris.[10]UN(2015).UnitedNationsGloballyHarmonizedofChemicals(GHS),FifthRevisedEdition,UNNewYorkandGeneva.Availableat:[/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].[11]MielkeH.,StricklandJ.,JacobsM.N.,MehtaJ.M.(2017)BiometricalEvaluationofthePerformanceoftheRevisedTestGuideline402forAssessingAcuteDermalToxicity.Inpress.Regu-latoryToxicologyandPharmacolo[12]OECD(2002).OECDGuidelineforTestingofChemicals:AcuteOralToxicity-FixedDoseProcedure(No.420).OECD,Paris.[13