蛋白质多肽液相色谱纯化方法简介 液相色谱解决方案

第第页蛋白质多肽液相色谱纯化方法简介液相色谱解决方案蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介！1、纯化的一般目标和方法首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分别的样品。然后进行捕获色谱（capturechromatography），重要目标是浓缩和去除大量的简单去除的杂质，此步挂念的是流速和载量，常采纳高载量、快流速凝胶。经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediatechromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步挂念的是辨别率，常采纳高辨别率的细颗粒凝胶。后为了得到符合要求的终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishingchromatography），常采纳具有高辨别率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。2、纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验a、测定样品在pH2—9的稳定性；b、测定样品在0—4mol/LNaCl及0—2mol/L硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0—50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4—40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。（2）样品预处理a、去除样品中颗粒物（0.45—0.22微米膜过滤或者10000g离心15分钟）b、去除样品中脂类（10000g离心15分钟或有机溶剂抽提）c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第1步分别或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）（3）样品的保存条件：短期储存（小于24小时）a、避开接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者hao冻干（真空冷冻干燥）保存。3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋白含量测定紫外汲取法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G—250）等。c、样品多而杂度检测HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS—PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。4、蛋白质的来源（1）天然蛋白：天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极多而杂，在分别过程中须采纳多步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。（2）重组蛋白：重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白重要有三种表达定位：a、细胞质：在种情况下，必需破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且简单通过高速离心分别，但是包涵体的溶解与复性是较多而杂的。b、外周质：表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并削减了宿主蛋白的污染。c、分泌到培育基：这种表达一般蛋白质浓度较低，重要受到培育基中的污染。液相色谱填料流动相配制的特点液相色谱填料由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分构成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工获得正确牢靠的试验数据的必经之路。液相色谱填料的使用过程中，若碰到使用不当的情况，会大大缩短色谱柱的使用寿命。为了延长色谱柱的使用寿命，应对色谱柱进行适当的保护。液相色谱填料是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分别的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有肯定的溶解本领，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。b、流动相具有肯定惰性，与样品不产生化学反应（特别情况除外）。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分别效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用uv检测器，可以使用对紫外汲取较低的溶剂配制。e、流