实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)

5/6实验四逆转录PCR(RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA（complementDNA）合成（即RNA的反转录（RT，reversetranscription）），同cDNA的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的基本原理（图4.1）。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。在RT时，有3种引物可选择（表4.1)。用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3）方法，先要去查它的序列，并用oligo等软件设计引物。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点（表4.2），cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适当的接头(Linker)，接头可以是在PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经PCR扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。本实验是要从小鼠肝脏组织中获取Fas配体基因，Fas配体(FasL)是一分子量约为40u的II型跨膜糖蛋白，属TNF家族成员。活化的T细胞可表达Fas和FasL，并通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中FasL表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。我们采用RT-PCR方法克隆FasL全长cDNA并构建其表达载体，可以为进一步研究FasL的功能提供条件。在上下游引物的5’端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基（即HindIII和BamHI），以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pGFPUv上（附录图4.3）。为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pGFPUv，在其上加了6×His标签。【实验安排】1．第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理（0.1%DEPC浸泡或高温干烤）。2．第二天：进行（一）逆转录和（二）PCR扩增。3．第三天：进行（三）琼